摘要: 目的：该文旨在比较运用八种骨组织脱钙液后，病理制片的HE染色效果，以找到一种更加高效，综合效果更好的方法应用于临床工作当中。方法：选取家兔股骨骨干部分24份，修成1.5 cm × 0.5 cm × 0.2 cm的骨块，平均分成A、B、C、D、E、F、G、H八组，分别用A、B、C、D、E、F、G、H八种脱钙液在常温下进行脱钙处理，记录脱钙过程的时间，最后比较八组样本的染色质量。结果：G组(JYBL-II脱钙液)脱钙时间24 h，时间最短，F组(JYBL-III脱钙液)染色效果最好。D组(福尔马林–甲酸溶液)、E组(Krajian改良Evan-Krajian脱钙液)及G组(JYBL-II脱钙液)染色效果欠佳。A组(10%硝酸溶液)、B组(5%甲酸溶液)、C组(Richmon Gelfonud-Hill脱钙液)和H组(JYBL-I脱钙液)染色效果一般。结论：在八种脱钙液中，骨组织制片后HE染色质量及效果最好的为JYBL-III脱钙液。
Abstract:
Objective: This article aims to compare the HE staining effects of pathological slices after using eight kinds of bone tissue decalcification solutions, in order to find a more efficient and comprehensive method for clinical work. Methods: Twenty-four parts of femur diaphysis of rabbits were selected to form 1.5 cm × 0.5 cm × 0.2 cm bone blocks, which were evenly divided into eight groups A, B, C, D, E, F, G and H and treated with eight kinds of decalcification solutions A, B, C, D, E, F, G and H respectively at room temperature. The process of decalcification was recorded, and the staining quality of the samples in the eight groups was compared. Results: The decalcification time of group G (JYBL-II decalcification solution) was 24 hours, the shortest time, and the staining effect of group F (JYBL-III decalcification solution) was the best. The staining effect of group D (formalin-formic acid solution), group E (Krajian modified Evan-Krajian decalcification solution) and group G (JYBL-II decalcification solution) was not good. The staining effects of group A (10% nitric acid solution), group B (5% formic acid solution), group C (Richmon Gelfonud-Hill decalcification solution) and group H (JYBL-I decalcification solution) were average. Conclusion: Among the eight kinds of decalcification solutions, the best quality and effect of HE staining after bone tissue preparation is JYBL-III decalcification solution.
1. 引言
骨组织作为人体最为坚硬的特殊组织，标本制作过程相对复杂、技术要求较高，其标本制作的每一步都对最后的成片质量具有很大影响，尤以脱钙这一环节最为重要，所选脱钙液将直接影响到脱钙后HE染色的效果。在日常工作中，海南医学院第一附属医院乃至海南省多家医院病理科一般均使用10%硝酸溶液进行脱钙，但制片效果一般，因强酸性脱钙液易使组织酸化，抗原性受到破坏，组织不适宜做免疫组化和分子病理，HE染色时胞核等组织着色不均匀，颜色欠鲜艳，对比度较差，组织细胞结构和细胞核等欠清晰，从而影响病理学诊断；并且，临床一般要求常规片4天出结果，因此，探索出一种更加高效，综合效果更好的脱钙液具有重要意义 [1]。本研究通过实验比较了八种脱钙液的脱钙效果，为病理科医生在日常制片等方面提供相应的参考和依据，现报告如下。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
选取海南医学院实验动物中心同一只2.2公斤成年家兔的股骨骨干样本平均切分为24份，平均分为A、B、C、D、E、F、G、H八组各3份。确保各组骨组织无差异。
2.2. 制备脱钙液
以临床医院病理科老师及文献提供的信息为参考，用10%硝酸为脱钙液进行家兔股骨骨组织的标本制作为参照组，选取了中国协和医科大学出版社的《实用现代病理学技术》第一版一书中所提5%甲酸、Richmon Gelfonud-Hill脱钙液等八种脱钙液，配制如下：
1) A组脱钙液(10%硝酸溶液)：浓硝酸10 ml加蒸馏水90 ml；
2) B组脱钙液(5%甲酸溶液)：甲酸5 ml加蒸馏水95 ml；
3) C组脱钙液(Richmon Gelfonud-Hill脱钙液)：
浓甲酸10 ml，浓盐酸8 ml，蒸馏水82 ml；
4) D组脱钙液(福尔马林–甲酸溶液)：
甲酸50 ml，甲醛5 ml，蒸馏水45 ml；
5) E组脱钙液(Krajian改良Evan-Krajian脱钙液)：
80%甲酸100 ml，95%乙醇100 ml，醋酸钠20 g，三氯醋酸1 g加蒸馏水100 ml；
6) F组脱钙液(JYBL-III脱钙液)：
甲酸50 ml，甲醛10 ml，蒸馏水40 ml；
7) G组脱钙液(JYBL-II脱钙液)：
盐酸20 ml，甲酸30 ml，甲醛20 ml，蒸馏水30 ml；
8) H组脱钙液(JYBL-I脱钙液)：
盐酸8 ml，甲醛5 ml，甲酸12 ml，蒸馏水75 ml。
2.3. 处理方法
2.3.1. 材料与仪器
八种脱钙液、基本实验操作器械，如：手术刀、剪刀、镊子等、石蜡包埋机、石蜡切片机、生物组织脱水机、摊烤片机、显微镜等。
2.3.2. 脱钙方法
首先取新鲜离体家兔股骨骨干部分24份，修成1.5 cm × 0.5 cm × 0.2 cm的骨块，在常温下用10%中性福尔马林固定24 h。然后分别将3份置于八种脱钙液中(每瓶脱钙液为100~200 mL)，在相同温度下浸泡一段时间(一般为24 h)后，检测是否到达脱钙终点 [2]。(采用两条标准：1) 用一次性5 ml头针能够无阻力地穿过，且明显软化。2) 取5 ml标本脱钙瓶中需检测的脱钙液与1 ml的5%草酸钙溶液混合摇匀，如液体混浊说明仍有钙质，如放置5 min后仍无沉淀，表示已脱钙完全 [3]。
2.3.3. 脱钙后标本处理
标本脱钙完成以后，对其进行自来水冲洗12 h，之后进入常规脱水包埋程序；如尚未到达脱钙终点，则需流水冲洗30 min，再脱钙12 h，重复此步骤直至到达脱钙终点为止。需要注意的是，若骨块距离第一条标准相差甚远，则更换脱钙液并流水冲洗后，继续浸泡相同时间周期再行检测。所有标本脱钙完成后常规脱水，高熔点石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，全自动封片机封片后镜下观察。
2.4. HE染色效果评判标准
显微镜下切片骨组织结构完整、染色清晰。细胞核呈蓝紫色，颜色鲜明，与细胞质层次分明，对比明显，判断为良好，达不到以上标准则视为欠佳 [3]。
3. 结果
3.1. 比较八种脱钙液的脱钙时间
A、B、C、D、F及H组脱钙时间一致，为72 h，G组脱钙时间最短，为24 h，E组脱钙时间最长，为336 h，推荐作为密皮质骨脱钙使用，见表1。
Table 1. Comparison of the decalcification time and HE staining effect of the eight groups of tablets
表1. 八组制片的脱钙时间及HE染色效果对比
3.2. 比较八组制片的染色效果
D、E及G组染色效果欠佳，F组(JYBL-III脱钙液)染色效果最好，剩余其他组染色效果一般，见表1，染色图片具体见图1~8。
Figure 3. Richmon Gelfonud-Hill decalcification solution
图3. Richmon Gelfonud-Hill脱钙液
Figure 4. Formalin-formic acid solution
图4. 福尔马林–甲酸溶液
Figure 5. Krajian’s modified Evan-Krajian decalcification solution
图5. Krajian改良Evan-Krajian脱钙液
Figure 6. JYBL-II decalcification solution
图6. JYBL-III脱钙液
Figure 7. JYBL-II decalcification solution
图7. JYBL-II脱钙液
Figure 8. JYBL-I decalcification solution
图8. JYBL-I脱钙液
3.3. 综上所述
不同种类的脱钙液对脱钙及染色效果有较大的影响，综合效果最好的脱钙液为JYBL-III脱钙液(甲酸50 ml，甲醛10 ml，蒸馏水40 ml)。
4. 讨论
骨组织为坚硬的一种特殊组织，它致密、坚硬，含大量的钙盐，钙盐一般遇酸后溶解组织才会变软 [4]。脱钙就是将骨组织里的钙盐与胶原纤维分离 [5]，同时能避免脱钙液对骨组织结构的影响，使脱钙后的组织变得相对柔软和疏松，可以进行石蜡切片，并能制出组织结构清晰完整的切片 [6]。常用的脱钙剂主要包括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等 [7]。强酸性脱钙液易使组织酸化，抗原性受到破坏，不适宜做免疫组化和分子病理。螯合剂是一种比较温和的脱钙剂，但对组织的渗透性差作用慢，不适于病理学标本制作。脱钙过程最重要的就是确定脱钙终点，如果脱钙不完全，则更极易造成切片的碎裂甚至损坏刀具，对骨组织的制片需要一定的技巧和经验，要把握好每个技术细节，才能真正达到骨组织制片的最佳效果。实验过程中采用全自动脱水机等设备，保证了部分条件一定，降低非相关因素对实验的影响，从而保证了最终实验效果具有科学性。
本研究从八种脱钙液脱钙的时间、HE染色效果两方面比较发现，G组脱钙液(JYBL-II脱钙液)的脱钙时间最短，为24 h，A、B、C、D、F、H组脱钙液脱钙的时间为72 h，E组脱钙液脱钙的时间为336 h，F组标本的染色效果是最好的。F组脱钙液(JYBL-III脱钙液)的成分有甲酸50 ml，甲醛10 ml，蒸馏水40 ml。甲酸对骨组织脱钙较温和，且组织的损伤较小，同时对细胞核染色效果好，但作用较弱，脱钙速度慢。而甲醛既是良好的固定剂，又兼具穿透速度快，脱钙能力强的特点，可以在抗酸侵蚀的同时加强对组织的固定。因此，这两种物质按比例进行混合使用能更大程度上缩短脱钙过程、减少组织破坏，实现较好的染色效果。
基金项目
校级大学生创新创业课题(X201911810104)。
NOTES
*通讯作者。