1. 引言
乳酸菌是一类能利用发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌在自然界中分布广泛，主要分为乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和片球菌属。由于乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、促进人体营养吸收、增强人体免疫力等益生作用，乳酸菌在食品发酵、医药等行业中应用越来越广泛 [1] [2]，而且有望在更多领域得到应用。目前对乳酸菌的检测出现了多种新型技术 [3]，但大多沿用传统检测方法。因此选用一个合适的培养基非常重要。
MRS、莫匹罗星锂盐改良的MRS培养基(以下简称改良MRS培养基)是GB4789.35-2016中使用的分别检验乳酸菌、双歧杆菌的培养基 [4]。MRS是大多数工业发酵生产乳酸菌常用的基础培养基。由于不同种类的乳酸菌对营养的需求都不一样，国内对不同的乳酸菌的最佳生长因子已有大量的研究 [5] [6]。
由于每个厂家生产使用的原料不同，不同厂家的同一种培养基可能在感官、生物学上会存在差异。本研究通过对不同厂家来源的MRS培养基和改良MRS培养基的pH值、促生长能力以及抑菌能力进行质量评估，比较平板上多种乳酸菌的生物学差异，为广大检验工作者选择合适的培养基提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 菌株及其来源
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) CICC6071、婴儿双歧杆菌(B. infantis) CICC6069、FC13644、乳双歧杆菌(B. lactis) FSCC 118004、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii) CICC6032、FC13657、FC13658、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) IFFI 6038、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus) As 1.1878、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus) ATCC7469、植物乳杆菌(L. plantarum) ATCC8014。以上菌株均来自广东省食品微生物安全工程研究中心。
2.2. 仪器与试剂
WASP2全自动螺旋接种仪(英国Don Whitley公司)；Smartcounter自动菌落计数仪(广东环凯微生物科技有限公司)；DNP-9272型恒温培养箱(广东环凯微生物科技有限公司)；
培养基：MRS培养基、改良MRS培养基分别来源于厂家I (本实验室)、国内其它品牌：厂家II、厂家III。
2.3. 方法
2.3.1. 培养基制备和pH值测定
MRS琼脂、改良MRS培养基的配制均按生产厂家说明书进行，制备成平板备用，同时在25℃恒温使用平头凝胶电极测定各培养基的pH值。使用前置于20℃~50℃培养箱中，直至培养基表面的水滴消失。
2.3.2. 目标菌生长情况及特征测试
将选用的目标菌的新鲜培养物制成一定浓度的菌悬液，用全自动螺旋接种仪螺旋接种于3个厂家的MRS和改良MRS平板上，于37℃，厌氧培养72 ± 2 h，计数并测量各株菌在3个厂家MRS、改良MRS上的生长情况及菌落直径，每个平板进行3个重复，并进行统计。
2.3.3. 选择性试验
将非目标菌采用已验证的MRS平板复苏，37℃培养48 h后，分别用接种环挑取一环，加入到30 ml 8.5 g/L生理盐水中配成原液(n × 108 cfu/ml)，分别用1 μL接种环取选择性测试工作菌悬液1环，在待测改良MRS培养基及对照MRS平板表面划六条平行直线(如图1)，同时接种三个平板。37℃培养约48 h。培养后按以下方法对培养基计算生长指数G。每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6。如果仅一半的线有菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。选择性抑制菌在待测培养基上生长指数G应小于1。
Figure 1. Inoculation pattern of non target bacteria by semi-quantitative scribing method
图1. 非目标菌半定量划线法接种模式图
2.3.4. 数据分析方法
数据分析采用SPSS18.0软件，以P < 0.05表示差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. MRS培养基pH值比较
在GB 4789.35-2016中给出了MRS培养基的配方，其中规定了MRS培养基pH值的范围为6.2 ± 0.2。三个厂家培养基的pH值(25℃)如表1所示，测试结果显示三个厂家培养基的pH均在合格范围内。
Table 1. pH value of test medium (25˚C)
表1. 测试培养基pH值(25℃)
3.2. MRS培养基生长情况比较
三个厂家的MRS培养基对不同乳酸菌的生长菌落数与菌落大小如表2、表3所示。结果显示三个厂家的MRS培养基生长菌落数(除乳双歧杆菌FSCC 118004)的差异有统计学意义(P < 0.05)。大多数目标菌在厂家I的MRS培养基上比厂家II和III的更大，有利于菌落计数。厂家III的MRS培养基上的嗜酸乳杆菌As 1.1878在48 h内不能生长，有5株乳酸菌的菌落较小。
Table 2. The colony number of the tested strains on MRS agar for 48 h
表2. 测试菌株在MRS琼脂上48 h的菌落数
Table 3. The colony diameter of the tested strains on the MRS agar for 48 h
表3. 测试菌株在MRS琼脂上48 h的菌落大小
三个厂家的改良MRS培养基对不同双歧杆菌的生长菌落数如表4所示。厂家III的改良MRS上有两株双歧杆菌48 h不能生长，三个厂家培养基的生物学效果差异有显著性(P < 0.05)。
Table 4. The colony number of the tested strains on the modified MRS agar for 48 h
表4. 测试菌株在改良MRS琼脂上48 h的菌落数
3.3. 抑菌能力比较
三个厂家的改良MRS培养基对7株非目标菌的抑菌能力结果如表5所示，三个厂家的改良MRS培养基都能抑制所选的非目标菌(G ≤ 1)，三个厂家的培养基抑菌能力相当。
Table 5. The selectivity of tested strains on modified MRS agar
表5. 测试菌株在改良MRS琼脂上的选择性(G)
4. 讨论
培养基的质量直接影响了实验结果，实验室不得使用不符合要求的培养基 [7]。培养基的质量包括了感官、理化及生物学等方面。感官的好坏会影响对实验结果的评定。理化包括了培养基的水分、凝胶强度、pH值等方面。通常在培养基配制后都需要烘干后备用，水分含量取决于平板烘干时间。只要保持平板的烘干时间在合适的范围内，水分对培养基的影响不大；凝胶强度则取决于各厂家添加的凝固剂用量，通常培养基厂家都会把凝胶强度控制在合适的范围内；pH值对于部分微生物的生长影响较大。在配制过程中，所使用干粉的保存状态，灭菌时间与灭菌后的保温时间等，都会对pH值产生较大影响。因此在培养基配制过程中，需严格按照各厂家的配制方法进行配制 [8]。在本实验中，三个厂家的MRS平板的pH值都在标准要求的范围内，符合要求。
由于不同厂家使用的培养基原料来源不同，导致培养基的生物学效果出现细微的差异。实验中发现厂家III的嗜酸乳杆菌As 1.1878不能生长，部分乳酸菌的菌落也较小，可能会对后续实验造成影响。厂家I和厂家II的目标菌生长菌落数相当，但厂家I的菌落大小均大于或等于厂家II，有利于目标菌的计数或培养。
改良的MRS培养基中，莫匹罗星锂盐可抑制大部分非双歧杆菌乳酸菌的生长。但用量过大时，也会对双歧杆菌的生长产生一定的抑制作用。蔡芷荷等 [9] 研究表明，莫匹罗星锂盐添加量为5~7.5 mg/L时，不同的双歧杆菌菌株均生长良好。对于非目标菌，莫匹罗星锂盐为5 mg/L时，对嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等非目标菌抑制良好。半胱氨酸盐酸盐是抗氧化剂，可以去除培养基中残存的氧，对于严格厌氧的双歧杆菌生长起到促进作用。本研究也发现添加了半胱氨酸盐酸盐的改良MRS相比无半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基，双歧杆菌菌株的生长会更优。三个厂家的改良MRS都能抑制所选的非目标菌，符合GB4789.28-2013中对选择性培养基的要求(G ≤ 1) [10]。但厂家III有两株目标菌不能生长，可能与其配套试剂中的莫匹罗星锂盐用量较大有关。
5. 结论
综上所述，厂家I的MRS和改良MRS培养基的目标菌生长情况总体上优于厂家II和厂家III，对非目标菌的抑制能力三个厂家的性能相当。由于本次研究所选用的菌株有限，如需对这两款培养基进行更全面的评价，后续还需使用更多不同种类的乳酸菌或实际样品来验证。当购买某一种培养基或换用培养基的厂家时，对购买的培养基进行适用性检查，有利于保证实验的准确性。
基金项目
国家重点研发计划(2018YFC1604201)；肇庆市引进西江创新团队项目(肇人才领2018-8)。
参考文献
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。