1. 引言
截叶铁扫帚为豆科(Leguminosae)胡枝子属(Lespedeza)植物的干燥全草，全国各地均有分布，多以全草入药 [1]。现代药理实验研究表明，截叶铁扫帚具有抗氧化、抗炎抗菌、抗卵巢癌、保肝等多种生理活性。文献报道 [2] - [15] 截叶铁扫帚的化学成分有黄酮类、木脂素类、酚酸类、糖类、挥发油、苷类、苯丙素等。但尚未有应用LC-MS对截叶铁扫帚化学成分进行研究的报道。
液质联用技术操作简便，检测灵敏度高，分离能力强，简单迅速。目前主要应用于环境检测、中药多组分分析、中药体内代谢物分析、质控研究等领域中。为了更好的开发利用截叶铁扫帚的药用价值，探索其生物活性的物质基础，为截叶铁扫帚的质量控制研究、临床应用、资源开发提供理论依据。为明确截叶铁扫帚化学成分，本文采用液质连用方法对其醇提物进行化学鉴定。
2. 材料与仪器
2.1. 药材
截叶铁扫帚购于同仁堂贵阳药店，经贵州医科大学药学院徐冉老师鉴定为豆科植物截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata (Dum. Cours.) G. Don.)的干燥全草。
2.2. 仪器与试剂
超高效液相色谱(H-Class Acquity, waters, USA)、四极杆飞行时间质谱仪(Xevo G2-XS Qt of waters, USA)、UNIFI科学信息系统(1.8, waters, USA)。
乙腈、甲醇(HPLC、默克、德国)，甲酸(LC/Ms、赛默飞、中国)，蒸馏水(屈臣氏、中国)，其余试剂均为分析纯。
3. 方法与结果
3.1. 样品的制备
称取适量截叶铁扫帚，加入10倍量的75%乙醇回流提取4 h，减压蒸除溶剂得黑色浸膏状物。取上述浸膏，用75%甲醇溶解稀释成1 mg∙mL−1，高速离心(13,000 r∙min−1*10 min)，取上清液待用。
3.2. 液质条件
液相条件：色谱柱BEH C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 um, Waters ACQUITY)；进样量3 ul，柱温40℃，流速0.3 mL/min；流动相：0.01%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0~2 min 90% A；2~5 min 90%~70% A；5~8 min 70%~30% A；8~15 min 30%~20% A；15~28 min 20%~2% A；29 min 2%~90% A；29~30 min 90% A。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正负模式参数相同，采集模式为MSe轮廓图。数据采集范围m/z 50~1200。碰撞气氩气；雾化气(N2)体积流量为600 L/h，脱溶剂气温度为350℃，锥孔气流量为50 L/h，离子源温度110℃，毛细管电压2.0 kV，高能量扫描电压30~40 V。
3.3. 结果
通过MassLynx V4.1软件进行数据采集，将所得数据在UNIFI平台中快速匹配数据库，选择误差小于10ppm的化合物通过对比对照品、查看二级质谱碎片离子信息、查阅文献、结合质谱裂解规律等方法推断鉴定化合物成分及来源。正模式下共推断和鉴定化合物82种，负模式共推断和鉴定化合物19种，结果分别见表1和表2。
正负模式下的色谱图及鉴定结果
采集的数据以时间(分钟)为横坐标，一级质谱峰高百分比为纵坐标绘图，分别得到图1和图2。对两张图上主要色谱峰进行数字标识，后结合该色谱峰的母离子峰和碎片离子峰进行结构确证。根据色谱峰保留时间，鉴定出的分子式、一级质谱、加合物的形式、真实值与理论值的误差、二级碎片和鉴定的化合物进行制表，分别得到表1和表2。
Figure 1. Base peak ion flow diagram of Lespedeza cuneata ethnol extract in positive mode
图1. 截叶铁扫帚醇提物UPLC-Q-TOF-MSE正模式下的基峰离子流图
Table 1. Identification results of positive mode Lespedeza cuneata
表1. 正模式下截叶铁扫帚鉴定结果
Figure 2. Base peak ion flow diagram of Lespedeza cuneata ethnol extract in negative mode
图2. 截叶铁扫帚醇提物UPLC-Q-TOF-MSE负模式下的基峰离子流图
Table 2. Identification results of negative mode Lespedeza cuneata
表2. 负模式下截叶铁扫帚鉴定结果
4. 讨论
4.1. 黄酮及其苷类的鉴定
黄酮类化合物是天然化学成分中一类常见的化学成分，在胡枝子属中发现了黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类等成分，多以成苷的形式存在。在本研究中发现了32个黄酮类化合物，如异荭草素、阿福豆苷、红蓼素、黄芩苷等。与糖结合成苷的化合物在质谱中以糖基的断裂为主，如峰9的[M+H]+为727.2076，采用元素分析得出分子式为C32H38O19，有[M+H-Ara]+ 577.154、[M+H-Ara-Glu]+ 413.085等碎片离子，皆为母核结构失去糖基后的碎片，结合Chemspider数据库搜索碎片离子进行匹配，推断出峰9为王不留行黄酮苷。
峰44与峰37在正模式下均观测到[M+H]+为287，两个峰分析出的分子式为C15H10O6，且在UNIFI数据库中匹配的化合物误差在5 ppm以内，对二级质谱图进行分析，发现两者的碎片有所不同，峰44的碎片有153和137，而峰37则出现了118与119的碎片，和文献 [16] 对比判断出峰44为木犀草素，峰37为异黄芩素。峰5在负模式下观测到的m/z为447.0947，在质谱信息中可观察到脱去一分子葡萄糖后再中性丢失H2O得到268的碎片以及发生RDA裂解的133碎片，可以确定糖连接在A环上，其裂解途径如图3，结合文献信息 [17] 确定为红蓼素。
Figure 3. Pyrolysis pathway of orientin
图3. 红蓼素的裂解途径
4.2. 苯丙素及其苷类的鉴定
苯丙素类化合物是截叶铁扫帚中另一类重要的化学成分，包括木脂素类和香豆素类，本实验共鉴定了18个化合物，其中有3个香豆素类和3个木脂素类化合物，观察发现均出现了CO或者CO2的中性丢失。74号峰在ESI+观测到[M+NH4]+ 262.1433，分子中有丢失213的碎片，推测其结构中有正丙烯结构，对比文献 [18] 判断74号峰为蛇床子素，峰20在正模式下有m/z为399.103的碎片，判断结构中有糖基相连，且质量数误差为0.1 ppm，通过在线数据库搜索，得到峰20的化学名为1,3-dihydroxy-D-glucopyranoside。
4.3. 醌类化合物的鉴定
目前在截叶铁扫帚中发现的醌类化合物较少，本次研究中鉴定6个醌类化合物，分为苯醌、奈醌和蒽醌三类，此类化合物与黄酮类化合物的质谱裂解有相似之处，都有CO碎片离子的出现。在负模式下8号峰根据分子式以及结构式等对应数据库中的化合物为2,5-二甲基苯醌，再通过一二级质谱图在线搜索，发现二级质谱中有CH3的碎片，综合分析后鉴定8号峰为对二甲基苯醌。54和62号峰在ESI+的保留时间接近，且分别有167和151的碎片，推断这两个峰可能为同一类化合物，并且相差一个氧，再结合文献 [19] 判断54号峰为大黄素，62号峰为1-羟基-3-甲氧基蒽醌。
4.4. 萜类化合物的鉴定
综合保留时间、特征碎片离子和质谱裂解规律共推断出14个萜类化合物，主要有单萜、环烯醚萜、三萜等。因萜类化合物母核结构较多，无特殊裂解规律，常因每一种化合物的结构不同而有不同的裂解方式。36号峰准分子离子峰为[M+Na]+,推断出分子式为C11H16O3，二级质谱有丢失正丙醇碎片，结合文献 [20] 和数据库判定36号峰为黑麦草内酯。峰13在ESI+观测到的m/z [M+Na]+ 409.1825，分子式为C19H30O8，裂解碎片为[M+H-Rha-OH]+ 207.138,在此基础上再中性丢失H2O，得到189.127的碎片，查阅文献 [21] 鉴定为roseoside。
4.5. 其他类化合物的鉴定
本次研究鉴定了其他类化合物11个，其中包括糖类如蔗糖、景天庚酮糖等，有机酸如天师酸、2-羟基-丁二酸以及儿茶素等，嘌呤类如鸟嘌呤、腺苷等。11号峰在低能量区可观测到准分子离子峰[M+H]+ 291,高能量区有139.039、123.043、153.055的碎片，为C环的1,4和1,3的断裂形成的碎片，综合文献 [23] 分析出11号峰为儿茶素。峰1在ESI-模式下[M-H]− 341.109，分子式为C12H22O11，在负模式下糖发生裂解，分析碎片[M-H-Glu-H2]− 177、[M-H-Fru-CH2-H20]− 129等，结合文献 [24] 鉴定为蔗糖。
5. 结论
本文数据分析采用了waters的UNIFI分析软件，结合已知文献建立化合物数据库，并充分利用chemspinder在线数据库，根据化合物二级质谱并结合化合物结构特点，正模式下共推断出82种化学成分。该方法快速简便地分析出了截叶铁扫帚的化学成分，为下一步研究截叶铁扫帚的物质成分与作用机制奠定了理论基础。
NOTES
*通讯作者。