摘要:
目的：儿童淋巴结肿大在临床中很常见，病因很多，通过临床详细体格检查、实验室检查以及病理检查，能够确诊。EB病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染是引起儿童期淋巴结肿大的重要原因，EBER检测是确定EBV感染的金标准，探讨其在儿童淋巴结活检中的意义。方法：收集伴有浅表淋巴肿大的行淋巴结活检术的患者60例，病理标本全部行EBER检测，对其临床、实验室资料、病理、预后进行统计分析。结果：60例淋巴结肿大患儿，19例行淋巴结切除活检，39例行淋巴结穿刺活检术，组织坏死性淋巴结炎占22例(36.7%)，肿瘤性疾病占15例(25%)，EBV感染和传染性单核细胞细胞增多症占11例(18.3%)，其余诊断占12例(20%)。所有患者行组织病理检查，其中EBER检测阳性的14例，在传染性单核细胞疾病中占比例最高(100%)。中位随访37个月，EBER阳性患者的无事件生存期明显短于EBER阴性患者，有统计学意义(P < 0.01)。结论：EBV感染是导致小儿浅表淋巴结肿大的重要病因，EBER阳性患者更能更容易出现疾病复发，需要动态长期随访。
Abstract:
Objective: The children lymph node enlargement is very common in the clinic, the etiology is many, through the clinical detailed physical examination, the laboratory examination and the pathological examination, can diagnose. EB virus infection is an important cause of infantile lymphadenopathy. EBER test is the gold standard for determining EB virus infection and discusses its significance in pediatric lymph node biopsy. Methods: 60 cases of lymph node biopsy with superficial lymphatic enlargement were collected. All pathological specimens were examined with EBER, and their clinical, laboratory data, pathology, and prognosis were statistically analyzed. Results: 60 children with lymph node enlargement, 19 lymph node resection biopsies, 39 lymph node puncture biopsy procedures, 22 cases (36.7%) of tissue necrotizing lymphadenitis, 15 cases (25%) of tumor diseases, EB virus infection and infectious monocytes increased 11 cases (18.3%). The remaining diagnosis accounted for 12 cases (20%). Histopathological examinations were performed in all patients, of which 14 were positive for EBER and accounted for the highest proportion of infectious mononuclear cell diseases (100%). In 37 months of median follow-up, the non-event lifetime of EBER positive patients was significantly shorter than that of EBER negative patients and was statistically significant (P0.01). Conclusion: EB virus infection is an important cause of superficial lymphadenopathy in children. EBER positive patients are more likely to relapse and require dynamic long-term follow-up.
1. 引言
儿童浅表淋巴结肿大在临床工作中很常见，通过临床详细的体格检查和辅助检查一般能确诊病因 [1]；但一些特殊感染或肿瘤相关疾病导致的淋巴结肿大，需要活检才能确诊。EBV是一种常见的人类疱疹病毒，人类感染后可终生潜伏，儿童典型的EBV感染表现为传染性单核细胞增多症，以发热，肝脾淋巴结肿大，咽峡炎为特点 [2]，近年来，非典型EBV感染有所增多，表现为其他多样的临床表现 [3]；且很少从病理方面做出诊断，更少进行免疫表型和EB病毒原位杂交研究 [4]。因此淋巴结活检对明确诊断至关重要，本文探讨原位杂交方法EBER检测在儿童淋巴结活检中的意义。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
收集从2014年6月至2018年7月，在血液儿科住院行淋巴结活检的135例患儿，其中60例患者做了EBER检测。纳入标准：因淋巴结肿大于我科住院治疗，并行淋巴结活检的患儿；排除标准：患有导致淋巴结肿大的基础性疾病。
2.2. 检查和诊断方法
1) 进行淋巴结穿刺，取淋巴结组织做病理活检。2) 手术摘除淋巴结，做病理学检查诊断。3) 标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，切成厚4~5 um的组织切片行HE染色。EBER为人工检测，选用EBER原位杂交试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)并严格按照试剂说明书进行实验操作。EBER的原位杂交检测阳性为细胞核着色。阳性标准：仅观察细胞针对所标记抗原或核酸的表达和标记情况，为确保准确，规定在5%以上细胞有定位准确的阳性信号时方可判断为染色结果阳性 [1]。4) 特异性病毒学、免疫学检查，血清EBV抗体(VCA-IgG、VCA-IgM、EA-IgM、NA-IgG)、EBV DNA检测。
2.3. 随访
结合临床治疗反应，观察病情的动态变化，随访至发生事件或2019年1月，至少随访6个月以上。无事件生存时间(EFS, event-free survival)定义为从确诊到发生事件的时间，事件包括原发病病情反复或进展。
2.4. 统计学分析
使用SPSS 23.0统计学软件分析，配对四格表资料用卡方检验，生存分析用Kaplan-Meier生存分析。
3. 结果
3.1. 临床特点
全部60例患儿中男43例，女17例，男女之比为2.5:1，年龄1~13岁，中位年龄7.5岁。单个部位或单个淋巴结肿大13例，多部位或多个淋巴结肿大47例，其中颈部淋巴结肿大54例，颌下淋巴结肿大5例，腹股沟淋巴结肿大1例，伴有全身症状35例。全身症状为发热有33例，伴有肝大、脾大有8例，鼻塞1例，腹痛呕吐2例。
3.2. 疾病诊断
组织坏死性淋巴结炎22例，霍奇金淋巴瘤8例，反应性增生6例，非霍奇金淋巴瘤6例(间变大细胞淋巴瘤4例，伯基特淋巴瘤1例，未分类1例)，EB病毒感染5例，传染性单核细胞细胞增多症6例，淋巴细胞增殖性疾病3例，慢性活动性EB病毒感染1例，鼻咽癌1例，慢性淋巴结炎2例。
3.3. EBV病原学检测
EBV衣壳抗原IgM阳性有14例，EBV核抗原IgG阳性28例，EBV血清DNA载量阳性15例，阴性45例。
3.4. EBER原位杂交检测结果
淋巴结活检病理中，EBER阳性为14例，EBER阴性46例。EBER阳性14例中，EBV抗体分析阳性有4例，阴性有10例，EBV血清DNA载量阳性8例，DNA载量阴性6例。
其中EBER阳性表达中，传染性单核细胞细胞增多症6例，霍奇金淋巴瘤3例，EBV感染2例，淋巴细胞增殖性疾病1例，鼻咽癌1例，慢性活动性EBV感染1例。EBER阳性率在疾病种类中有统计学意义。不同性别的EBER阳性率无差异(χ2 = 0.982, P > 0.01)。年龄因素，小于10岁组比大于等于10岁年龄组EBER阳性率高(χ2 = 11.187, P < 0.01)。EBV抗体阳性组与阴性组的EBER阳性率无统计学差异(χ2 = 4.467, P > 0.01)，而EBV血清DNA载量阳性组比阴性组的EBER阳性率高，有统计学意义(χ2 = 15.031, P < 0.01)。
3.5. 生存时间
最长随访时间为54个月，最短随访时间是7个月，中位随访时间为37个月。其中2例死亡，其余存活，EBER阳性患者中有事件的5例(35.7%)，EBER阴性患者中有事件的1例(2.17%)，EBER阳性患者的EFS明显短于EBER阴性患者，有统计学意义(如图1)，Log Rank检验(χ2 = 15.031, P < 0.01)。
Figure 1. Survival curve of EBER positive and negative groups
图1. EBER阳性和阴性两组患者生存曲线
4. 讨论
淋巴结是人体重要的免疫器官，临床工作中，儿童淋巴结肿大并不少见。因为儿童自身发育的特点，免疫系统活跃，淋巴组织较成人增生明显，尤其是颈部淋巴结肿大尤为常见。正常儿童颈部淋巴结最大垂直直径一般不超过1 cm，婴幼儿则可达1~2 cm，质地柔软，表面光滑，可移动，无压痛。否则为病理性淋巴结肿大。儿童淋巴结肿大往往反映局部或全身淋巴组织增生，包括感染、免疫、肿瘤等多种原因 [5]，随着医学技术的进步，发现很多疾病的早期表现为淋巴结肿大。因此儿童淋巴结肿大，尤其是反复出现的，一定不能漏诊，需查明原因。儿童淋巴结活检是最准确有效的明确病因的方法。由于儿童自身特点、手术风险、麻醉风险等，近年来，细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration cytology, FNAC)作为一种可靠的诊断方式，成为一种快速、微创、准确性高的诊断方法，被临床医师及患者广泛接受 [6] [7]。本组60例浅表淋巴结肿大患儿，最后诊断组织坏死性淋巴结炎比例最高(36.7%)，肿瘤性疾病共占25%，非肿瘤性EBV相关疾病占25%，其余病人占13.3%，以上结果与文献报道一致，表明小儿浅表淋巴结肿大的病因复杂多样 [8]。
EBV感染是导致儿童淋巴结肿大的重要病因，目前已被广泛重视 [9]。该病毒主要以潜伏感染的形式存在于健康人群，而潜伏感染状态时，膜潜伏蛋白(LMP)及EBV核抗原(EBNA)等病毒蛋白产物都相对较少，检测时容易出现假阴性结果。Lerner等(1981) [10] 发现，EBV编码的小RNA (EBV-encoded RNA, EBER)是EBV的非编码RNA，大量存在于EBV潜伏感染的细胞中。研究证明，EBER可以诱导几种细胞因子的活化，进而促进EBV感染的肿瘤细胞的增长。EBER对固有免疫信号的调节作用，是EBV致癌的重要因素 [11]。同时，EBER具有稳定的二级结构，因此不像细胞内其他的RNA分子容易降解。所以针对EBER的检测就变得至关重要。EBV检测常用的方法有血清EBV抗体检测、血清EBV-DNA滴度检测、聚合酶链反应、免疫组化和原位杂交技术 [12]。前3种方法主要用于病毒的普查、筛选及分型；后两种方法由于能够确定病毒与组织和细胞的关系而具有定位作用。免疫组化方法检测的是LMP或 EBNA等EBV蛋白产物。原位杂交检测的则是EBV编码的RNA。免疫组化方法对于细胞内低拷贝数的EBV感染，阳性检出率远不及原位杂交方法。所以，在EBV的定位检测上，EBER原位杂交方法具有更高的敏感性和特异性。本研究中，儿童淋巴结肿大EBER检测阳性占23.3%。其中EBER阳性表达的疾病分布，传染性单核细胞细胞增多症6例，霍奇金淋巴瘤3例，EBV感染2例，淋巴细胞增殖性疾病1例，鼻咽癌1例，慢性活动性EBV感染1例。EBER阳性率在疾病种类中有统计学意义。本研究中，组织坏死性淋巴结炎患者病例数最多，但是无EBER阳性病例，这也提示组织坏死性淋巴结炎与EBV感染关系不明确，与文献报道一致 [13]。不同性别的EBER阳性率无差异，小于10岁组比大于等于10岁年龄组EBER阳性率更高，这可能与本科收治儿童年龄最大为14岁，大于10岁年龄组患者数量相对少有关。EBV抗体阳性组与阴性组的EBER阳性率无统计学差异(c2 = 4.467, P > 0.01)，而EBV血清DNA载量阳性组比阴性组的EBER阳性率高，有统计学意义(c2 = 15.031, P < 0.01)。从理论上符合EBV在体内复制过程，提示EBER检测的重要意义，对于诊断EBV感染相关疾病具有确诊价值。EBV与肿瘤的相关研究已经非常广泛，尤其儿童常见的霍奇金淋巴瘤几乎90%以上有EBV感染 [14]，在本研究中，肿瘤性疾病EBER阳性率占26.7% (4/15)，分析原因可能与样本量小有关。在本研究中我们同样关注非肿瘤性疾中EBER阳性表达，我们发现所有传染性单核细胞细胞增多症的EBER检测均为阳性，有研究 [15] 表明患过传染性单核细胞细胞增多症的患者发生霍奇金淋巴瘤的几率比普通人高4倍。而本研究也发现EBER阳性与阴性在无事件生存时间有显著的统计学差异，研究中我们也观察到传染性单核细胞增多症患者生发中心的EBER阳性细胞，这可能为解释EBV相关霍奇金淋巴瘤的发生提供参考 [4]。因此，在儿童淋巴结肿大者，对EBER检测阳性的患者注意长期随访管理，可能比EBER阴性患者更容易出现病情反复，甚至恶性转化。不足之处：淋巴结穿刺活检中，尽管多方向、多点取材等，仍有取材少或者涂片不清等易致漏诊；且病理诊断往往被认为是诊断的金标准，因此对病理医师的要求较高。
NOTES
*通讯作者。