1. 引言
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，是临床常用中药。丹参的有效成分主要包括两大类：以丹参酮类为代表的脂溶性成分和以丹酚酸类为代表的水溶性成分 [1] [2]，其中在丹参酮类化合物中，丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA的含量较高 [3]。由于丹参药材受品种、产地、采收期等因素的影响 [4] [5]，其所含主要成分相差较大，因此应严格控制丹参药材的质量。
中药材成分复杂多样，大多靠几种成分协同发挥药效，单一成分含量难以全面反映中药质量，因此，多指标成分的含量测定成为中药质量评价的新模式。但同时测定药材中的几种成分又存在对照品难得的问题，致使采用多指标成分评价中药质量的模式在实际应用中受到限制。“一测多评”方法的提出及应用 [6] [7] [8]，在一定程度上有效解决了这一矛盾。“一测多评”即只测定一个成分(对照品供应充足、容易获者)，通过建立该成分与其他成分(对照品难以得到或难供应者)间的相对校正因子，计算出其他成分的含量，实现多成分的同步测定。本实验采用HPLC法，以丹参酮IIA为内参物，采用一测多评法同步测定了丹参中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的含量，为丹参药材的质量评价提供了依据。
2. 实验材料与方法
2.1. 仪器和试剂
LC-10AT高效液相色谱系统(日本岛津)，EC2006高效液相色谱系统(大连依利特)；色谱柱：Hypersil ODS2(4.6 × 250 mm，5 µm)，SinoChrom ODS-BP(4.6 × 200 mm，5 µm)，Wondasil C18(4.6 × 250 mm，5 µm)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA(上海晨易生物科技有限公司)，丹参药材购于泰安漱玉平民大药房，甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2.2. 对照品溶液的制备
取二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品适量，精密称定，分别置棕色量瓶中，加甲醇溶解，配制成对照品储备液：二氢丹参酮I 0.1 mg/ml，隐丹参酮0.5 mg/ml，丹参酮I 0.7 mg/ml，丹参酮IIA 0.5 mg/ml，避光保存。分别精密吸取1 ml二氢丹参酮I，1 ml隐丹参酮，1 ml丹参酮I，1 ml丹参酮IIA对照品储备液同置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解定容，得混合对照品溶液，低温避光保存，备用。
2.3. 供试品溶液的制备
取丹参粉末(过3号筛)约0.3 g，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140 W，频率42 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
Hypersil ODS2(4.6 × 250 mm，5 µm)色谱柱；甲醇–水(77:23)为流动相；柱温30℃；流速1.0 ml/min；检测波长255 nm，进样量20 μl。在上述色谱条件下，各待测成分分离度良好，对照品及样品HPLC图谱见图1。
1-二氢丹参酮Ⅰ；2-隐丹参酮；3-丹参酮Ⅰ；4-丹参酮ⅡA
Figure 1. HPLC chromatograms of Salvia miltiorrhiza standards and samples solutions
图1. 丹参对照品(A)和丹参样品(B)的HPLC色谱图
3.2. 线性范围
精密吸取上述混合对照品溶液，分别稀释1、5、10、15、20、25倍，配制成系列浓度的混合对照品溶液，分别进样，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以峰面积积分值对各对照品的浓度进行线性回归，结果如表1所示，各标准曲线在一定范围内线性良好。
Table 1. Standard curve of four kinds of active ingredient in Salvia miltiorrhiza
表1. 丹参中4种有效成分的标准曲线
3.3. 精密度试验
精密吸取上述混合对照品溶液，连续进样6次，计算得二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IA峰面积的RSD分别为1.9%、0.7%、1.3%、0.9%，表明仪器精密度良好。
3.4. 稳定性试验
取同一供试品溶液，室温避光放置，分别于0，1，2，6，10，18，24，36 h进样，计算得二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA峰面积的RSD依次为1.9%、1.1%、1.2%、1.3%，表明供试品溶液在室温条件下避光放置36 h内稳定。
3.5. 重复性试验
称取同一批次丹参药材粉末约0.3 g，共6份，按1.3项下操作，制备6份供试品溶液，分别进样测定，按外标法计算，得二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的质量分数的RSD分别为1.3%、1.5%、1.1%、1.6%，表明方法重复性良好。
3.6. 回收率试验
取同一批已知含量的丹参药材粉末约0.15 g，9份，精密称定，按各成分在药材中的含量不同分别精密加入高、中、低3个浓度水平的二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品，制备供试品溶液，进样，计算加样回收率，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的加样回收率分别为100.2%，99.5%，100.3%，100.4%，RSD值分别为1.0%，0.9%，1.4%，0.4%。
3.7. 校正因子的重现性考察
3.7.1. 不同仪器和色谱柱的影响
取1.2项下配制的系列浓度的混合对照品溶液，分别进样。以丹参酮IIA为内标，分别计算丹参酮IIA对二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的相对校正因子，相对校正因子的计算如下式所示 [9]：
为内标物丹参酮IIA与组分χ之间的相对校正因子，
为内参物丹参酮IIA的质量(浓度)，
为内参物的峰面积，
为组分χ的质量(浓度)，
为组分χ的峰面积。
分别考察了EC2006，LC-10AT 2种高效液相色谱系统和Hypersil ODS2(4.6 × 250 mm，5 µm)，SinoChrom ODS-BP(4.6 × 200 mm，5 µm)，Wondasil C18(4.6 × 250mm，5 µm)3种色谱柱对各相对校正因子的影响，结果表明，不同仪器和不同色谱柱对各成分的相对校正因子无显著影响，结果见表2。
Table 2. Effects of different instruments and columns on relative correction factor
表2. 不同仪器和不同色谱柱对相对校正因子的影响
3.7.2. 待测组分色谱峰的定位
为了在仅采用1个对照品时，能够确认其它3个成分色谱峰的位置，分别采用丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I与丹参酮IIA色谱峰间的保留时间差和相对保留时间2个参数作为色谱峰定性依据，并考察了这2个参数在不同仪器和不同色谱柱上的重现性，见表3。结果表明，丹参酮IIA与其他3个待测成分相对保留值波动较小，保留时间差波动较大，因此选用相对保留值作为其他3个待测成分色谱峰的定位参数。
Table 3. Different instruments and columns of the target composition relative retention value
表3. 不同仪器和不同色谱柱下目标成分的相对保留值
3.8. 样品测定
取丹参药材，按照1.3项下要求制备供试品溶液，进样测定，分别采用外标法和一测多评法(丹参酮IIA的含量测定采用外标法计算，其他三种成分根据校正因子计算公式计算)计算丹参药材中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量。结果见表4，表明两种方法所得结果一致。
Table 4. Results of sample determination
表4. 样品测定结果
4. 结论
本实验采用HPLC法，以丹参酮IIA为内标物，建立其与二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的相对校正因子，用外标法测定药材中丹参酮IIA的量，根据相对校正因子计算二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的量，实现了一测多评。同时将外标法测定所得4个成分的量与一测多评法所得结果进行比较，二者无显著性差异。一测多评法可用于丹参药材多指标成分含量测定。
基金项目
山东省大学生创新创业训练计划(S201910439044)，泰安市科学技术引导计划(2019ZC245)。
NOTES
*通讯作者。