Notch信号通路活化在COPD中的作用

The Role of Notch Signaling Pathway in COPD

摘要: 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种持续存在的气流受限，呈进行性发展，伴有气道和肺慢性炎症反应的常见疾病。Notch是一种跨膜蛋白，通过直接的细胞–细胞间接触调节慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压和肺癌的病理生理功能过程。本文就Notch信号与COPD的关系对近来的研究进行综述，重点讨论了Notch信号通路活化参与免疫炎症紊乱、气道上皮–间质转化、肺间质纤维化，促进Klotho甲基化加重肺损伤等可能的COPD新病理机制，为临床治疗COPD提供新思路。

Abstract: Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a common disease that is characterized by the progressive, persistent restriction in airflow and chronic inflammation of the respiratory tract and lungs. Notch is a transmembrane protein that regulates the pathophysiological processes of COPD, pulmonary hypertension, and lung cancer through direct cell-cell contact. This mini-review focuses on the illustration of the relationship between the Notch signaling and COPD in terms of the involvement of Notch signaling pathway in immune inflammatory disorders, airway epithelial-interstitial transformation, pulmonary fibrosis and the promotion of Klotho methylation aggravating lung injury, which provides new insights into the pathological mechanisms and clinical treatment of COPD.

1. 引言

慢性阻塞性肺气肿(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种持续存在的气流受限，气流受限呈进行性发展，伴有气道和肺对有害颗粒或气体所致慢性炎症反应的增加的常见疾病。COPD的全球患病率为10.1%，40岁以上人群慢性阻塞性肺疾病的患病率达到13.7% [1]。2017年，COPD导致全球320万人死亡 [2]，预计这一数字到2040年将达到每年440万人次 [3]。

目前普遍认为COPD发病机制与慢性炎症、氧化应急与抗氧化失衡等有关 [4]。近年来的研究表明Notch信号在肺发育、损伤和修复中起着关键作用，Notch信号的失调可导致多种呼吸系统疾病，如COPD、肺间质肺纤维化(Pulmonary interstitial fibrosis, PIF)等疾病 [5]。因此，了解Notch信号在COPD病理生理过程中的作用与机制，为临床COPD的治疗提供潜在生物靶点。

2. Notch信号通路及活化

Notch信号通路是一种高度保守的信号通路，通过控制细胞的增殖、分化和凋亡来决定细胞的命运。哺乳动物细胞中的Notch信号通路包括Notch受体(Notch1-4)和配体，后者包括三个delta-家族配体 (delta-like 1-3, DLL1-3)和两个Serrate-家族配体(Jagged1-2, Jag1-2) [6]。该信号通路的激活涉及三步酶切(蛋白质水解)过程。Notch受体前体被高尔基体内的Furin蛋白酶在S1位点切割，形成的异聚体被运输到质膜上；与配体结合后，TACE (TNF-α-converting enzyme)，一个去整和素-金属蛋白酶家族酶(a disintegrin and metalloprotease, ADAM)在Notch受体的S2位点切割，释放部分胞外片段，留下膜粘连的胞内部分；随后早老素(presenilin, PS)依赖的γ-分泌酶(γ-secretase)在Notch受体的S3位点切割，释放细胞内域(Notch intracellular domain, NICD)的COOH末端部分。NICD进入细胞核中，与转录因子CSL (CBF-1, Suppressor of hairless, Lag的合称)相互作用，调节Notch靶基因如Hes (hairy and enhancer of split)和Hey (hes-related family basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor with YRPW motif 1)的表达，影响细胞分化与胚胎发育 [7] [8]。

杯状细胞增生与气道阻塞有关是COPD的主要特征之一。鼻病毒导致COPD患者急性恶化，延长时间的气道阻塞。Jing等 [9] 的研究发现鼻病毒感染的COPD细胞的Notch1，Notch3和Hey1表达增加，阻断Notch3或者γ-分泌酶抑制剂减弱或者抑制了鼻病毒诱导的杯状细胞增生黏液基因表达。于COPD患者，Boucherat等 [10] 研究发现活化的Notch1受体和效应基因Hey2的表达水平上调，促进了气道杯状细胞分化和黏液过度产生，而γ-分泌酶抑制剂可抑制该病理过程的发生。在气道损伤的实验模型中，Xing等的研究发现Notch1的活性是修复气道上皮所必需的：Notch1的缺乏降低了肺部无纤毛(clara)细胞的增殖；Notch1的下游靶基因，Hes5和含配对盒基因6 (Paired box protein, Pax6)的表达与Clara细胞的再生有关；阻断Notch1可减少Hes5和Pax6表达，并抑制气道上皮修复 [11]。这些研究表明调控Notch信号可能是一种有效治疗气道损伤的策略 [12]。

3. COPD的免疫炎症机制

COPD的慢性气流阻塞特征是慢性肺部炎症的结果，免疫细胞在COPD的炎症机制中起着重要作用。免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、及T和B淋巴细胞，释放炎症介质，即保护受伤部位不受感染，也造成了组织的破坏 [13]。

CD4⁺ T细胞为辅助性(T helper, Th) T细胞，在不同的刺激下分化成Th细胞(Th1、Th2以及Th17)或调节性T细胞(regulatory T cell, Tregs)。Th1细胞主要分泌白介素2 (interleukin 2, IL-2)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 和干扰素γ (Interferon gamma, IFN-γ)等细胞因子，有助于消除细胞内病原体，并参与细胞免疫、巨噬细胞活化和迟发性超敏反应 [14]。INF-γ能通过调节诱导细胞趋化因子(CXCL10)的表达，介导基质金属蛋白酶12 (Matrix metalloproteinase-12, MMP-12)也称为巨噬细胞金属弹性蛋白酶(macrophage metalloelastase, MME)或巨噬细胞弹性蛋白酶产生，抑制分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的产生，促进了COPD气道炎症和肺气肿的过程 [15]。而Th2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等因子，参与变态反应和防御寄生虫感染。Th2细胞能抑制Th1细胞介导的免疫应答，在Th1反应增强、Th2减弱时，分泌基质金属蛋白酶降解肺细胞外基质、活化弹性蛋白酶，最终导致弹性蛋白水解和肺气肿形成 [16]。

Th17细胞是另一种T细胞亚群，IL-6和TGF-β的共同作用促进其分化，主要分泌IL-17等促炎细胞因子。Th17在COPD中的表达增高可能加重了肺组织的破坏，造成肺气肿 [17]。IL-17可以促使气道分泌大量黏液，增加气道的反应性，从而在气道重塑的过程中发挥重要的作用 [18]。

Treg细胞主要分泌IL-4和IL-10等抑炎性细胞因子，抑制T细胞增殖和细胞因子产生，叉头状转录因子3 (forkhead box protein 3 (Foxp3) transcription factor)是其特异性转录因子。Treg细胞与患者的免疫功能有关，可间接反映肺部和气道的炎症程度，参与COPD的发病过程。

Treg、Th17同属T细胞，在作用上相互遏制。Th17细胞促进炎症反应，Treg细胞则抑制炎症反应，Th17/Treg的平衡在维持机体正常免疫功能方面有着重要作，两者作用失衡，可导致机体免疫紊乱 [19]。在COPD中，Th17细胞表达上调而Treg细胞减少。张占强等 [20] 在COPD患者外周血中发现高Th17/Treg比值与COPD病情严重程度密切相关。COPD患者T淋巴细胞亚群相关的细胞因子比例失衡与持续存在的慢性炎性反应和肺功能损害呈密切相关 [21] [22]。COPD可引起全身炎症增加，通过炎症级联反应激活肺组织中炎症因子过表达，是导致肺损伤的重要原因 [23]。因此阻断炎症的发展是治疗COPD等慢性肺部疾病的主要手段。

4. Notch信号通路活化参与免疫炎症紊乱

Notch信号可通过对CD4⁺T细胞亚群Th1、Th2、Th17、Treg分化和功能的调节而实现对机体免疫功能的调控 [24]。Yang等 [25] 人发现COPD小鼠存在T淋巴细胞亚群失衡，以Th1、Th17等促炎细胞增多为主，导致Notch1及其下游Hes1 mRNA及蛋白水平升高，而γ-分泌酶抑制剂，GSI能部分抑制Th1、Th17细胞的增多及Notch1、Hes1的表达。Gu等 [26] 的研究发现COPD小鼠脾脏中的Th1与Th17细胞数、血清IFN-γ、IL-17浓度显著增加；Th2与Treg 细胞数、血清IL-4和IL-10浓度明显降低；Th1/Th2及Th17/Treg比值增加；Notch1-4的mRNA和蛋白质的水平、Hes1、Hes5、Hey1表达增加。这些结果表明COPD小鼠存在Th1和Th17介导的免疫紊乱，Notch信号通路在COPD疾病中处于过度激活状态，而GSI可以通过抑制Notch信号通路的激活，缓解COPD状态下的免疫紊乱。因此调节Notch信号通路，可纠正T淋巴细胞亚群(Th1/Th2, Th17/Treg)的失衡达到减缓炎症效果。

非典型Notch配体家族的Delta/Notch样EGF相关受体蛋白(Delta/Notch-like EGF-related receptor, DNER)，是一种跨膜蛋白，虽名为受体蛋白，但其能作为配体与Notch1受体结合，激活Notch信号。GWAS分析发现DNER与COPD的严重程度相关 [27]。近来研究评估了DNER在COPD患者和慢性香烟烟雾(CS)暴露的鼠COPD模型中的作用：免疫荧光染色显示COPD患者和小鼠肺组织中的巨噬细胞DNER的表达增加；DNER缺陷小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)表现出NICD1 /核因子KB (nuclear factor kappa b, NFkB)依赖的IFN-γ信号传导受损和NICD1/NFKB核易位的减少。DNER缺陷小鼠巨噬细胞的IFN-γ产生和Notch1的激活均降低，阻断了CS诱导的COPD模型小鼠肺功能障碍，这些结果表明DNER是一种COPD患者和CS暴露小鼠中诱导产生的新型蛋白质，可通过募集促炎性巨噬细胞中的Notch受体调节IFN-γ的分泌 [28]。这些结果提供了COPD的一个新的免疫机制，可能有助于发现新的治疗靶标。

5. Notch信号参与COPD的其他机制

5.1. Notch信号通路活化参与气道上皮-间质转化

COPD主要特征是气道重塑所致的气道阻塞。气道重塑的发生与气道炎症引起的气道上皮组织的反复损伤和修复有关 [29]。Godinas等 [30] 人研究表明在COPD的气道重塑组织学基础是上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，是一个上皮细胞失去细胞极性和细胞间粘附力，并获得迁移和侵袭特性，成为间充质干细胞的过程。EMT参与胚层发育，器官纤维化和癌症的转移。COPD患者存在Notch1信号及其下游的Hes1 mRNA和蛋白水平增加；CS暴露能够激活肺组织中的Notch信号 [25]，Notch配体和受体表达水平升高，尤其是Notch3 [31]。Hussain等 [32] 人发现Notch信号通路通过调节气道上皮EMT参与了气道重塑。因此抑制Notch信号通路的激活可以减轻COPD的免疫紊乱。Tilley等 [33] 在COPD患者气道上皮细胞证实了EMT的发生，气道上皮Notch3受体和下游基因Hes5均下调，配体DLL1和下游基因Hey1和Hey2下调，Notch信号通路通过相关基因表达下调可能参与了COPD气道重塑过程，故可通过调节Notch信号通路缓解气道重塑的过程。

转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)是一种介导多种细胞效应的细胞因子，TGF-β1是TGF-β的主要代表。TGF-β1可以调节免疫应答、成纤维细胞增殖与分化、组织修复与细胞外基质的形成。当受到炎症、烟雾等刺激时，单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等产生大量TGF-β、TNF-α、IL-8等炎症因子释放增加，使中性粒细胞趋化聚集于气道，并大量释放中性粒细胞弹性蛋白酶使气道平滑肌细胞活化，增加气道平滑肌细胞TGF-β1的分泌。TGF-β表达增加及其通路活化，作用于T细胞亚群Th17，释放IL17等促炎细胞因子进一步加强炎症反应。在COPD大鼠模型血清TGF-β1显著增高，肺功能降低 [34]。TGF-β诱导上皮细胞向间质转化，在COPD病理中发挥作用 [35] [36]。Notch信号在TGF-β1诱导EMT中的起到关键作用，这个作用涉及Snai1表达 [37]。通过γ-分泌酶抑制剂抑制或小干扰RNA敲低Notch信号，减轻EMT并减少Snai1表达。内源性Notch激足以诱导Snai1以及Notch配体Jagged1。这些数据表明，Notch信号激活通过Snai1的诱导促进TGF-β1诱导的EMT。

5.2. Notch信号通路活化参与COPD肺间质纤维化

COPD患者长期存在下呼吸道慢性炎症反应，其支气管和肺部反复感染，随着COPD病情进展，患者可出现PIF。目前研究认为其致病机制与多种因素导致的肺损伤异常修复相关。

参与慢性炎症反应的TGF-β1是最重要的促纤维化因子 [38]，可促进肺泡上皮细胞和成纤维细胞(fibroblast, FB)增殖 [39]。Vancheri等 [40] 人发现TGF-β1通过与相应的受体结合，刺激成纤维细胞(FB)增殖并诱导其向肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)转化，进而上调α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达，抑制细胞外基质(ECM)降解，增加ECM mRNA的表达和蛋白质的合成，同时抑制胶原降解，加重肺纤维化。符策富等报道了COPD和特发性肺纤维化(IPF)患者的粘液细胞表达Notch及其下游转录因子HES1，存在 Notch通路的激活 [41]。徐芳等 [42] 人研究发现Notch信号通路激活，通过Notch1和α-SMA蛋白水平上调，参与了肺纤维化中成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化过程，在抑制Notch信号通路的激活情况下达到减轻肺纤维化的作用。Notch信号的激活促进MUC5AC表达的粘膜细胞的分化，而Notch的阻断则有相反的效果，表明减少的Notch信号可能能减缓疾病进程 [43]。

5.3. Notch信号通路活化促进Klotho高甲基化加重肺损伤

长期暴露于空气污染和香烟烟雾(CS)是COPD诱发和发展的两个主要危险因素。其主要发病机制是CS引起的异常性肺部炎症和氧化损伤。然而，临床数据显示，只有10%~20%的慢性吸烟者会发展为COPD，这表明其他因素也参与了COPD的恶性进展。在年轻的慢性阻塞性肺病患者中，肺老化生理特征的患病率增加，这表明COPD的发展与老化有关。

Klotho是一种主要在肾脏中产生的抗衰老的单次跨膜蛋白，其氨基末端的胞外域脱落到全身循环中。 可溶性Klotho的循环水平随着年龄的增长而下降，并且Klotho基因与年龄相关疾病的风险增加相关。Klotho缺陷小鼠表现出与人类衰老相似的症状，包括生长停滞、皮肤萎缩、寿命缩短和肺气肿，而Klotho过表达延长小鼠寿命 [44] [45]。研究表明Klotho与COPD的发生发展相关，COPD患者和COPD小鼠肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞中的Klotho表达降低。此外，香烟烟雾提取物抑制了Klotho的表达，促进COPD相关炎症反应、氧化应激和细胞损伤 [46]。

Klotho启动子上游区域包含丰富的CpG，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)作用下进行DNA甲基化。Klotho启动子的甲基化调节了Klotho的表达。氧化应激可能会促进Klotho甲基化。 COPD的发展激活了多种与炎症相关的信号通路如Notch信号。研究表明CSE刺激降低了Klotho表达，激活了Notch信号通路，继而促进Klotho启动子的CpG甲基化。Notch介导的α-Klotho高甲基化抑制了Klotho的表达，促进了炎症反应和细胞凋亡，从而加剧了COPD的发展。抑制Klotho也影响NFKB，MAPK和Nrf2信号通路 [47] [48]，导致CSE诱导的炎症反应，氧化应激和细胞损伤增强。因此，维持Klotho表达被认为是COPD的潜在治疗手段 [49]。

6. 总结

综上所述，Notch信号通路与COPD有着直接或者间接联系，其在免疫失衡、气道阻塞、肺间质纤维化和黏液高分泌、肺巨噬细胞IFN-γ产生及介导α-Klotho表达抑制等COPD多个病理过程涉及，促进COPD病理改变。目前的研究主要集中在经典的Notch信号通路上，使用γ分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号的传递，能够改善COPD疾病转归和发展。因此，未来的研究应深入探索Notch信号通路参与调控COPD发生的作用机制，以及其与其他信号通路的关系，以期为预防和治疗COPD寻找有效的干预措施。

NOTES

^*通讯作者。