1. 引言
臭鳜鱼为新鲜鳜鱼腌制发酵后的产物,因其生“臭”熟香 [1] 、味道鲜美、风味独特 [2],成为徽菜的代表之一。影响臭鳜鱼风味的物质较多,脂肪族醛类是较为重要的一大类 [3],研究表明,脂质降解和氧化会产生脂肪族醛类 [4]。一般而言,影响脂类物质水解的酶主要有脂肪酶和磷脂酶 [5]。
本文以臭鳜鱼为研究对象,对加工过程中不同部位肌肉的酸脂酶、中性脂肪酶和磷脂酶活性的变化情况进行研究,以期为臭鳜鱼的深入研究提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验试剂
Na2HPO4、柠檬酸、氢氯酸、C4H11NO3、Na2-EDTA、Triton X-100、NaF、95%乙醇、CuSO4、酒石酸钾钠,均为分析纯。
2.1.2. 仪器设备
匀浆机,722紫外分光光度计,电子天平,恒温数显水浴锅,荧光分光光度计,pH计,控温磁力搅拌器,冷冻离心机。
2.2. 实验方法
工艺流程
原料处理、腌制→研碎→匀浆→离心→过滤→测粗酶含量→测酶活性
1) 原料处理、腌制将新鲜鳜鱼解剖清理,采用浓度为2%淡盐水室温下腌制(分别腌制1 d,3 d,5 d,7 d,9 d),取鱼肚和鱼背处鱼肉进行以下实验。
2) 研碎、匀浆称取鱼背和鱼肚处鱼肉各5 g,捣碎后,放入100 mL的烧杯,分别加入缓冲液A 50 mL,冰浴条件下,3000 r均浆15 s。
3) 离心、过滤 将匀浆完全的溶液放离心管内,5℃、10,000 r、离心15 min,抽滤,得粗酶提取液,待用。
2.3. 酶活的测定
1) 酸性脂肪酶
参照文献 [6]。取0.1 mL粗酶提取液,加入2.8 mL缓冲液B,混匀后,加入0.1 mL、1.0 mM (g/mol)的橄榄油作底物,37℃水浴保温30 min后,立即用0.5 mL 95%乙醇终止反应,用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
2) 中性脂肪酶
参照文献 [6]。取0.1 mL粗酶提取液,加入2.8 mL缓冲液C,混匀后,加入0.1 mL、1.0 mM的橄榄油作底物,37℃水浴保温30 min后,立即在冰水浴中冷却,1 min内用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
3) 磷脂酶
参照文献 [7]。取0.1 mL粗酶提取液,加入2.8 mL缓冲液D,混匀后,加入0.1 mL、1.0 mM (g/mol)的橄榄油作底物,37℃水浴保温30 min后,立即用0.5 mL 95%乙醇终止反应,用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
分别用缓冲液B、C、D配制不同浓度梯度的4-甲基形酮溶液,作标准曲线,定义1 g酶在1 h内生成1 mmol 4-甲基形酮,即为一个酶活单位,记为U。
2.4. 各种缓冲溶液的配置
缓冲液A:精确称取三羟甲基氨基甲烷6.057 g,Na2HPO4 18.612 g,Triton X-100 1.0 g,500 mL容量瓶定容。
缓冲液B:精确称取柠檬酸7.163 g,Na2HPO4 2.101 g,Triton X-100 0.05 g,牛血清 0.08 g,100 mL容量瓶定容。
缓冲液C:精确称取三羟甲基氨基甲烷2.665 g,Triton X-100 0.05 g,置于100 mL容量瓶,定容至快到刻度线时采用37%盐酸溶液滴定至pH7.5。
缓冲液D:精确称取Na2HPO4 7.163 g,柠檬酸2.101 g,NaF 0.63 g,牛血清0.08 g,100 mL容量瓶定容。
3. 结果及分析
3.1. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性脂肪酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位酸性脂肪酶活性变化情况见图1。
![](//html.hanspub.org/file/4-1740353x10_hanspub.png)
Figure 1. Changes of acid lipase activity in back and belly muscles during the production of smelly mandarin fish
图1. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性脂肪酶活性变化情况
由图1可知,臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位的酶活性变化尽管不同,但趋势基本一致,都是初期酶活性(鱼肚18,鱼背16)开始逐渐升高,到达临界点(鱼肚55,鱼背50)时开始降低,最后趋于平缓状态(鱼肚22,鱼背20)。而鱼肚的酶活性在过程中略大于鱼背的酶活性。
3.2. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的中性脂肪酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位中性脂肪酶活性变化情况见图2。
![](//html.hanspub.org/file/4-1740353x11_hanspub.png)
Figure 2. The changes of the neutral lipase activity of the back and belly muscles during the process of the production of smelly mandarin fish
图2. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的中性脂肪酶活性变化
由图2可知,腌制工艺能显著提高臭鳜鱼肌肉中中性脂肪酶的活性。随着腌制时间的推移酶活性(初期,鱼肚19,鱼背17)升高趋势减缓(后期,鱼肚36,鱼背30)且肚部的肌肉酶活性大于背部肌肉酶活性。
3.3. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性磷脂酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位酸性磷脂酶活性变化情况见图3。
![](//html.hanspub.org/file/4-1740353x12_hanspub.png)
Figure 3. Acid phospholipase activity of back and belly muscles during the production of smelly mandarin fish
图3. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性磷脂酶活性变化
由图3可知,臭鳜鱼肌肉中酸性脂肪酶活性在腌制工艺能显著提高(鱼肚3.420升至7.764,鱼背3.086升至6.891)。随着腌制时间的推移酶活性升高趋势减缓(鱼肚7.950,鱼背7.210)且肚部的肌肉酶活性大于背部肌肉酶活性,随着腌制时间的推移,酶活开始降低(鱼肚7.400,鱼背7.001)。从酶水解的反应物以及水解的类型来看,磷脂酶具有和脂肪酶相似的性质,但是这两种酶属于不同组酶,不属于丝氨酸水解酶一类的。
对于脂类物质前体而言,肉类的风味成分形成时,磷脂的贡献最大 [8],磷脂酶尽管与脂肪酶归属不同组酶,但是二者的反应底物和水解方式相似。研究发现,腌制金华火腿时,温度及盐是影响磷脂酶活性的主要因子 [9] ;板鸭加工时,盐份及水活度可很好地调控脂肪酶与磷脂酶的活性 [10]。因此,研究臭鳜鱼加工过程中脂肪酶和磷脂酶活性变化,对调节臭鳜鱼加工过程中的水解,控制脂肪氧化,提高产品风味,意义较大。下一步,应考虑温度、盐份及水活度对臭鳜鱼加工的具体影响。
4. 结论
在加工臭鳜鱼过程中,腌制前期和中期,酸性脂肪酶活性、中性脂肪酶与酸性磷脂酶的酶活基本上处于上升阶段,酶活随着时间的增加而增加,到腌制后期,酸性脂肪酶的活性开始下降,而中性脂肪酶与酸性磷脂酶的酶活变化不大。此外,鱼肚部位这三种酶活比鱼背部位的稍高。
基金项目
2018年国家级大学生创新创业训练计划项目(201811305031);2017安徽高等教育科学研究项目(KJ2017A567);安徽省教育厅省级名师工作室(2016msgzs044)。
NOTES
*通讯作者。