1. 引言
茶褐素是茶多酚、茶黄素和茶红素继续氧化和聚合的最终产物,是一类分子差异极大的复杂高聚合物 [1] [2] ,已有的研究表明茶褐素具有消食去腻、减肥防龋、降血脂、降低胆固醇等多种保健功能和显著的抗疲劳、降血脂的药理疗效 [3] [4] 。目前对于茶褐素的研究多集中在绿茶 [5] 、普洱茶和红茶方面 [6] - [11] ,而茯砖茶茶褐素抗氧化研究鲜见文献报道。何英姿 [12] 发现六堡茶茶褐素对羟基自由基的清除率高达74%,同条件低浓度情况下比Vc的高,对亚硝基的清除作用与Vc基本相当,最高可达73%,对超氧阴离子自由基的清除率最高为60%。周向军 [13] 研究发现乌龙茶茶褐素对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH具有一定的清除效果,虽清除效果均低于Vc,但在同类天然提取物中,茶褐素提取物仍具有明显优势,具有较大的开发价值。茯砖茶中的茶褐素(TB)含量很高,约占茶干量17.3% [14] 。本研究对茯砖茶中的茶褐素进行提取纯化,对其抗氧化活性进行研究,以期为茯砖茶茶褐素的开发利用提供理论参考。
2. 实验部分
2.1. 实验材料
茯砖茶(2018年产,湖南城院生物科技);正丁醇(天津富宇精细化工)、三氯甲烷(天津富宇精细化工)、乙酸乙酯(天津恒兴化学试剂)、无水乙醇(天津富宇精细化工)、双氧水(30%,广州华杭化工材料)、硫酸亚铁(天津大茂化学试剂)、水杨酸(济南英东化工)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, 北京中生瑞泰科技),均为分析纯;维生素C (Vc,≥ 99.7%,天津致远化学试剂)。
2.2. 溶液的配制
1) DPPH-乙醇溶液的配制:称取DPPH质量为2.0 mg,用25 mL无水乙醇溶解配成0.08 g·L−1的DPPH-乙醇溶液,放冰箱冷藏。
2) 水杨酸-乙醇溶液的配制:称取水杨酸34.53 mg,溶于50 mL容量瓶中,制成5 mmol·L−1的水杨酸-乙醇溶液。
3) 硫酸亚铁溶液的配制:称取水杨酸38 mg,溶于50 mL容量瓶中,制成5 mmol·L−1的硫酸亚铁溶液。
4) 双氧水配制:取27.77 mg 30%的双氧水稀释成4.9 mmol·L−1,现配现用。
4) Vc溶液配制:取1 mg溶于25 mL容量瓶中制成浓度为0.4 g·L−1,然后稀释成实验所需的浓度。
5) 样品溶液的配制:取茶褐素样品0.1 g分别溶于25 mL容量瓶中得4.0 g·L−1,然后将其稀释成实验所需浓度。
2.3. 茯砖茶中茶褐素提取纯化
按照文献 [2] ,将茯砖茶粉碎干燥到恒重后索氏提取,提取液用等体积的正丁醇萃取三次,得到水相,除去皂甙。水相再用等体积的三氯甲烷萃取三次,除去咖啡碱。将水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次,得到水相,除去茶黄素和茶红素,加过量的无水乙醇使茶褐素沉淀,过滤干燥得到茶褐素,其提取纯化流程见图1。本研究中,茶褐素提取率为16.1%。
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Figure 1. Flow chart of extraction and purification of theabrownine from fuzhuan tea
图1. 茯砖茶中茶褐素的提取纯化流程图
2.4. 茶褐素对羟基自由基的清除实验
茶褐素对羟基自由基的清除作用依据文献 [15] [16] 稍作修改。把三种样品配制浓度为4.0、2.0、1.0、0.50、0.25 g·L−1的样液,分别把不同样液在96孔板中滴入50 μL,5 mmol·L−1水杨酸-乙醇50 μL,5 mmol·L−1 FeSO4 50 μL,最后加入4.9 mmol·L−1 H2O2 50 μL启动反应,在恒温箱中37℃反应30 min。以蒸馏水和无水酒精体积比3:1混合液为空白对照,在510 nm下测量各待测液的吸光度。考虑到样品本身的吸光值,以5 mmol·L−1水杨酸-乙醇50 μL,5 mmol·L−1 FeSO4 50 μL,不同浓度的样液50 μL,用双蒸水代替H2O2,为茶褐素的背景吸收。考虑到其他液体的吸光值,以5 mmol·L−1水杨酸-乙醇50 μL,5 mmol·L−1 FeSO4 50 μL,不同浓度的样液用蒸馏水代替50 μL,最后加入4.9 mmol·L−1 H2O2 50 μL启动反应,为阴性对照吸收。计算清除率并进一步计算其IC50值。清除率(S)按照公式(*)进行计算。
(*)
A0为样品液的吸光度;Ax为样品液背景的吸光度;A为不加茶褐素溶液的阴性对照吸光度。
2.5. 茶褐素对DPPH自由基的清除实验
依据文献 [12] [13] [17] 的方法,把样品配制浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 g·L−1的样液100 μL,分别加0.08 g·L−1的DPPH-乙醇溶液100 μL,作为样品测试组A。蒸馏水与无水乙醇体积比1:1混合共200 μL作为参比液,100 μL蒸馏水加100 μL DPPH-乙醇溶液作为样品阴性组A;各浓度样品液100 μL加100 μL蒸馏水作为样品背景组Ax,将不同浓度样液按上述配比移入96孔板中,然后在恒温箱中37℃反应30 min。计算清除率并进一步计算其IC50值。清除率的计算依据公式(*)。
3. 结果与讨论
3.1. 茶褐素对羟基自由基清除作用
羟基自由基是新陈代谢过程中产生的作用最强、毒性最大的一种活性氧自由基,它能氧化损伤和破坏生物体内的核酸、蛋白质、脂类等大分子物质,导致疾病。因此,研究茯砖茶中茶褐素提取液对羟基自由基的清除能力具有重要意义。本研究采用水杨酸-Fe2+氧化法,其机理是利用茶褐素中的酚羟基与金属离子螯合,阻止OH生成。
茶褐素对羟基自由基的清除效果并以Vc作对比分别见图2和图3。从图可知,茶褐素对羟自由基的清除率随其质量浓度的增大而逐渐增高,且在2.0~5.0 g·L−1内其清除效果随其浓度的增加几乎成线性增长,但浓度达到4.0 g·L−1其对羟基自由基的清除率才超过50%,说明茶褐素对羟基自由基的清除作用不强。茶褐素是由茶多酚类物质进一步氧化而来,把酚羟基结构氧化成醛或羧基,导致茶褐素中含有的酚羟基结构少,从而与金属离子的螯合能力减弱,可能这是茶褐素对OH的抗氧化性不强的原因。经IC50软件计算知,Vc的IC50为0.0118 g·L−1,可知茶褐素对羟基自由基清除率不高,虽然仍然低于Vc,但茶褐素在天然提取物中仍然具有优势。
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Figure 2. Scavenging rate of hydroxyl free radical by theabrownine with different concentration
图2. 茶褐素对羟基自由基清除作用影响
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Figure 3. Scavenging rate of hydroxyl free radical by Vc with different concentration
图3. 不同浓度Vc对羟基自由基清除作用影响
3.2. 茶褐素对DPPH自由基清除作用
以Vc作对照测定茶褐素对DPPH自由基的清除率,见图4和图5。可知,在一定范围内茶褐素对DPPH自由基的清除率随其质量浓度的增大而逐渐增高,且在0.01~0.1 g·L−1内其清除效果随其浓度的增加呈急剧的线性增长,最高清除率可达到90%。经IC50软件计算知,Vc和不同纯度茶褐素的IC50分别为0.07 g·L−1、0.022 g·L−1,可知茶褐素具有很高的DPPH自由基清除率,茶褐素在天然提取物中具有很大的优势。
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Figure 4. Scavenging rate of DPPH free radicals by theabrownine with different concentration
图4. 不同浓度茶褐素对DPPH自由基清除
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Figure 5. Scavenging rate of DPPH free radicals by Vc with different concentration
图5. 不同浓度Vc对DPPH自由基清除作用影响
4. 结论
在对茯砖茶中茶褐素进行了提取纯化的基础上,对茶褐素的抗氧化性进行了对比性研究。茶褐素浓度为4.0 g/L时对羟基自由基的清除率达50.2%,具有一定的抗氧化性,但在低浓度下较Vc对羟基自由基的清除效果差。在低浓度下对DPPH自由基的清除率达到90%,但在低浓度下较Vc对DPPH自由基的清除效果强。茶褐素具有良好的抗氧化活性,在抗氧化应用方面有良好的前景,可为茯砖茶的深度开发提供数据支持。
基金项目
黑茶金花湖南省重点实验室(2016TP1022)、湖南省自然科学基金(2017JJ2018)。