1. 引言
虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是鲑形目中经济价值较高的类群,因其性成熟个体体侧有一条宽而鲜艳的彩虹带而得名,英文名rainbow trout,隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae),大麻哈鱼属(Oncorhynchus) [1] 。虹鳟原产于美国阿拉斯加地区的山川溪流中,现已成为世界上养殖范围最广的冷水性鱼类,同时也是我国重要的名优水产品之一。虹鳟与大西洋鲑统称鲑鳟鱼,属于市场价格适中的鲑鳟鱼类,颇受广大消费者的喜爱,鱼卵则可制成高档鱼子酱,属于高附加值水产品。
近年来,国内虹鳟养殖产业由于长期的近亲繁殖以及缺乏系统的选育,导致虹鳟养殖个体出现了性早熟、个体小型化、病害频发等问题 [2] 。虹鳟在进入繁殖期后,能量用来性腺发育,生长停滞,部分虹鳟会出现互相撕咬导致鱼体受伤的状况,极容易导致伤口感染,最终导致鱼体死亡。性成熟的虹鳟,不论雌雄都会出现抗病能力大幅度下降的状况,容易染病导致死亡。繁殖期的虹鳟肉质品质降低,严重影响了虹鳟养殖的经济效益。
三倍体虹鳟由于性腺发育程度低或发育受阻可以有效地改善以上问题,关于虹鳟三倍体的制种方面国内外都做过大量的研究,已有很多报道 [2] - [8] 。但目前国内还具备大规模生产三倍体虹鳟卵的能力,养鳟者只能进口不育的、大个体的全雌三倍体虹鳟发眼卵进行养殖以满足市场要求。可见,三倍体虹鳟卵或是全雌三倍体虹鳟卵的规模化生产已成为国内虹鳟养殖业的瓶颈。
目前鱼类多倍体诱导主要分为三个重要的方法,分别为化学法(A. 细胞松弛素、B. 秋水仙素、C. 6-二甲基氨基嘌呤等)、物理法(温度休克法、静水压法、电刺激法等)以及生物法(远缘杂交、细胞融合、核移植等)。国内外已经先后在鲤鱼 [9] 、黑鲷 [10] 、斑马鱼 [11] 、大黄鱼 [12] 、红鳍东方鲀 [13] 等30多种鱼类中成功诱导出三倍体。由于温度休克法较为廉价便捷,不需要专门的大型仪器,在大规模诱导鱼类多倍体中应用较多。在诱导溪鳟三倍体时采用28℃的休克温度在其受精后10 min,持续10 min,结果得到98%~100%的三倍体,相对存活率达到42%~100% [3] 。之前有研究用温度休克法诱导出黄颡鱼三倍体 [14] 。本文采用的是热休克法抑制受精卵第二极体的释放来诱导产生虹鳟三倍体,用来研究热休克法诱导虹鳟三倍体的适宜条件。
2. 材料与方法
2.1. 实验用鱼、试验药品器材
虹鳟二倍体亲鱼来源于山东省潍坊市临朐县玉福虹鳟养殖合作社,挑选个体较大、体外无伤、性腺发育良好且活力强的3~4龄的雌鱼和雄鱼,雌雄比例为2:1。
器材:电子恒温水浴锅、显微镜(解剖镜)、采卵盆若干、孵化网盆、塑料桶、孵化器多个、电子天平、温度计数根、秒表多个、烧杯多个、流式细胞仪、10 ml分子管若干等。
2.2. 人工授精
本实验采用湿法授精,同时把精子与卵子同时挤入到盛有单盐等渗液(等渗液的配置:1%的食盐水) [15] 的塑料盆中,用羽毛轻轻搅拌15~20 s使精卵混合均匀后,开始计时,作为受精的起点,静置3~5 min后,加入少许清水进行多次洗卵,洗卵过程中尽量去除过量的精液,未受精的死卵和亲鱼产生的血块等杂物。受精过程中避免强光照射,因此受精时间多在下午4点之后。
2.3. 三倍体诱导实验设计
本实验采用热休克法进行诱导,通过抑制受精卵第二极体的释放,来获得虹鳟三倍体。为找到较好的诱导条件,本试验对处理起始时间、温度大小和处理持续时间三个主要因素进行了三次试验,分别为两次三因素正交实验的重复实验(分组结果与处理方法见表1)以及一次起始时间与处理强度的双因素全实验(处理方法见表2)。处理起始时间为:精卵均匀混合到受精卵进入指定温度的恒温水浴锅中的时间;持续时间为:受精卵完全进入指定温度的恒温水浴锅中到离开水浴锅的时间;温度为:指定恒温水浴锅中的水温。
选取若干装有适量水的容器及恒温水浴锅,分别将水温调到20℃和相应的诱导温度。将洗净的受精卵放在自制的可透水的塑料筛盒中,浸没在盛有常温水的塑料盆中,每组卵在2000粒左右,诱导前5 min将装有受精卵的塑料筛盒置于20℃的水浴中预处理,并适量的充气搅动,目的是使受精卵在塑料筛盒中受热均匀,诱导时将每组卵快速转移至对应温度的恒温水浴锅中,同样进行充气使其受热均匀,诱导处理完毕后,再放回20℃的水浴中降温5 min,所有处理完毕后,分别将各组卵放入到指定的流水孵化桶
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. The table of orthogonal test on triploid salmon
表1. 虹鳟三倍体诱导正交试验因素水平表
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Two-factor experimental scheme for the initiation time and treatment intensity of rainbow trout triploid
表2. 虹鳟三倍体诱导起始时间与处理强度的双因素实验方案表
内进行流水孵化。
2.4. 苗种培育
各组虹鳟卵在自制的孵化桶内进行常规流水孵化,流水温度为10.5℃,溶氧为8 mg/L,孵化室内进行遮光处理,保证受精卵在孵化阶段所需要的暗光条件,并减少震动,每周使用甲基蓝对受精卵进行杀菌处理;孵化积温达到220度日,胚胎出现黑色的眼点后,挑除发白的死卵,统计各组的发眼率。
然后将发眼卵转移到自制的上浮筐中进行破膜上浮,当孵化积温达到约600度日时,仔鱼孵化出膜、吸收卵黄,待卵黄完全吸收,仔鱼开始自由游动时,统计各组的上浮率;开口投喂人工配合饲料,待到仔鱼长到3~5 cm时,统计各组的诱导率。
2.5. 样品采集与处理
在仔鱼体长3~5 cm时,每组随机取50尾进行断尾取血,将采集的尾静脉血用流式细胞仪和红细胞大小比较进行倍性鉴定。
流式细胞仪鉴定具体方法如下:
1) 单细胞悬液的制备:将虹鳟鱼苗用丁香酚麻醉后将其尾柄剪断,迅速插入到盛有1 mL 0.01 M的PBS缓冲溶液(pH 7.2~7.4)的分子管中,轻轻挤压鱼身,使血液缓慢流出,取血量在10 μL左右,然后摇匀,在常温下3000 rpm离心10 s,洗涤血细胞,倒掉上清液,再加入1 mL的PBS,混匀。
2) 单细胞悬液的固定:使用一次性塑料吸管吸取单细胞悬液,缓慢滴加到3 mL预冷的无水乙醇中,4℃过夜保存(至少固定3 h)。
3) 染色:将收集到的细胞悬液2000 rpm离心10 min,弃上清液,PBS洗涤2次,显微镜下将细胞浓度调至1 × 106个/mL,加入50 μg/mL的RNA酶20 μL,30 min后再加入1 g/L的PI染液20~50 μL,置于4℃冰箱中染色30 min,使用300目筛绢过滤。
4) 上机检测,以正常二倍体虹鳟血液样本作为对照组,检测实验组各样本的DNA含量,每个样本检测的细胞数目 > 104个,测量所得的数据和结果由计算机进行处理。三倍体虹鳟血液样本的DNA含量理论值应为正常二倍体的1.5倍左右。
红细胞大小比较具体方法如下:
将虹鳟鱼苗用丁香酚麻醉后将其尾柄剪断,迅速插入到盛有1 mL 0.01 M的PBS缓冲溶液(pH 7.2~7.4)的分子管中,轻轻挤压鱼身,使血液缓慢流出,取血量在10 μL左右,然后摇匀,4℃保存带回实验室,当天制作血细胞涂片,用PBS缓冲溶液对血细胞浓度进行适当稀释,用在显微镜下测量红细胞大小,重点是比较红细胞长径。
2.6. 数据分析
对实验组出现的二倍体、三倍体个数进行统计,计算发眼率、诱导率。三倍体诱导率=三倍体个数/总检测个数。所得到的实验数据发眼率、诱导率以及综合评分 [11] (诱导率与发眼率的和为100,诱导率占40%,发眼率占60%)均采用Excel软件进行整理。
3. 结果
3.1. 倍性鉴定结果
三倍体倍性鉴定结果:在流式细胞仪鉴定结果中,二倍体虹鳟红细胞的相对DNA含量约为310,三倍体虹鳟红细胞的相对DNA含量约为450 (图1),二者比值为1.45,接近于理论值1:1.5。在红细胞大小鉴定结果中,二倍体虹鳟的红细胞长径平均值为16 μm,与理论值结果一致 [16] ,三倍体虹鳟的长径平均值为20 μm (图2),三倍体虹鳟红细胞长轴为二倍体的1.25倍。
![](//html.hanspub.org/file/6-1030133x10_hanspub.png)
Figure 1. The DNA relative content of diploid and triploid rainbow trout
图1. 二倍体、三倍体虹鳟DNA相对含量
![](//html.hanspub.org/file/6-1030133x11_hanspub.png)
Figure 2. The red blood cells of diploid and triploid rainbow trout (40×10)
图2. 二倍体、三倍体虹鳟红细胞(40×10)
3.2. 热休克法诱导三倍体正交实验结果
发眼率结果分析中,影响发眼率最主要的因素(R值最大)为温度,其次是起始时间与持续时间温度,温度越高发眼率越低,在25℃时有最高的发眼率(表4)。在诱导率结果分析中,影响诱导率最主要的因素(R值最大)为温度,其次是持续时间与起始时间,在27℃存在最高的诱导率(表5)。在综合评分结果分析中,影响诱导效果的最主要因素为温度,其次是起始时间与处理时间,温度为25℃、27℃明显高于29℃,起始时间为15、20 min高于10 min,持续时间差异不明显,三个因素的最高值分别是起始时间为20 min,处理温度为25℃,持续时间为20 min (表6)。综合评分最高的为第七组(表3),处理参数为起始时间20 min、25℃处理20 min。
3.3. 热休克法诱导三倍体双因素全实验结果
在本次实验结果中显示,综合评分最高的一组为第一组,参数为起始25 min,25℃处理20 min,发眼率为70.00%,诱导率为88.89%,综合评分为77.56%。综合评分高于70.00%的共两组,分别为第一组、第二组,热休克的起始时间都是25 min (表7)。方差分析结果显示处理的起始时间与处理方式对于实验结果没有显著影响,但是起始时间为25 min的三组综合评分均值高于30 min、35 min。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 3. Average eye rate, average induction rate, and overall score for orthogonal experiments
表3. 正交实验的平均发眼率、平均诱导率以及综合评分
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 4. Average eye rate for orthogonal experiments
表4. 正交实验发眼率分析
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 5. Average induction rate for orthogonal experiments
表5. 正交实验诱导率分析
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 6. The overall score for orthogonal experiments
表6. 正交实验综合评分分析
4. 讨论
4.1. 处理强度对于热休克法诱导虹鳟三倍体的影响
在鱼类多倍体育种中,温水鱼或是热带鱼通常用低温进行温度休克诱导多倍体,冷水鱼通常用高温进行温度休克诱导多倍体 [17] 。虹鳟属于冷水性鱼类,用适当的高温刺激来诱导三倍体,温度过低会导致较低的诱导率,过高的温度虽然会产生较高的诱导率但也会产生很低的发眼率,因为较高的温度会使受
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 7. Average eye rate, average induction rate, and overall score for the two-factor full experiments
表7. 双因素全实验的发眼率、诱导率、综合评分
精卵受到损害,使其无法正常发育从而导致死亡。贾钟贺等在对金鳟受精卵进行热休克诱导过程中采用了26℃进行诱导,产生了较为理想的诱导效果 [6] 。张艳萍等人对虹鳟进行热休克诱导三倍体研究中发现,当诱导温度为26.5℃时产生了83.18%的三倍体诱导率,当诱导温度达到30℃时,虽然产生了90%以上的诱导率,但发眼率极低同时产生的苗种畸形率很高 [5] 。这与本研究结果相似,但不完全一致,在正交实验诱导虹鳟三倍体结果中表明,29℃的实验组发眼率普遍的低于同一起始时间的25℃、27℃实验组,但诱导率并未出现高于25℃、27℃实验组的现象。这一结果与王炳谦等人的研究结果相似,其研究结果表明,以26℃处理效果最佳,以28℃处理诱导效果较低。原因可能是由于温度过高,染色体断裂或缺失导致胚胎发育受阻而引起的 [2] 。
在本研究中显示,持续时间也是影响诱导效果的一个重要因素。在相同的处理温度下,持续时间越长,则处理强度越大,诱导率越高同时发眼率越低,三因素三水平正交实验结果中显示,作用参数为25℃持续20 min、27℃持续15 min会出现较高的综合评分,是较为理想的处理参数。这与宋宝坤等人在虹鳟卵受精20 min,26℃下持续处理时间为20 min可获得较高的孵化率和三倍体率的结果相似 [18] ,与张艳萍等的研究结果存在一定的差异,这可能是不同的受精卵质量、亲鱼质量引起的差异。有研究发现,母本的遗产因素会决定后代的生存能力,不同母本产生的卵子成熟度不一致或者相对脆性等因子不同会干扰处理效果 [19] [20] ,最终导致研究结果出现差异。
4.2. 起始时间对于热休克法诱导虹鳟三倍体的影响
热休克法诱导虹鳟三倍体是通过在第二极体释放之前给予适当的温度刺激,抑制受精卵第二极体的释放,以此使得受精卵中有三套染色体,从而培育出虹鳟三倍体苗种。卵子受精后,从第二次成熟分裂中期到第二极体排出这段时间,有丝分裂进程分为中期、后期、末期,分别对应于卵子启动期、休克敏感期、休克不应期 [21] ,确定虹鳟受精卵第二极体的释放时间段(休克敏感期)是能否成功诱导三倍体的一个重要因素。鱼类受精卵的第二极体释放时间受所处环境水温的影响,冷水性鱼类的第二极体释放较为缓慢,温水性鱼类的受精卵第二极体释放较快 [17] 。
Peter等在研究热休克诱导溪鳟三倍体时,在水温11˚C~12˚C的条件下,采用28℃水温在其受精后10 min开始刺激,处理持续时间10 min,三倍体诱导率高达98%~100%,且相对存活率也较高,在42%~100%之间 [3] ;王炳谦等在水温6.5℃,受精20 min后用26℃热休克处理20 min,得到三倍体诱导率为100% [2] ;张艳萍等人在26.5℃条件下,受精后15 min,处理持续10 min得到效果最佳 [5] 。楼允东等人认为虹鳟第二极体的排放时间大约在受精后15~40 min,在此时间内用热休克处理可以得到三倍体 [17] 。本次正交实验结果显示,虽然10 min、15 min、20 min的起始时间都出现过较高的诱导率,但起始时间为20 min的综合评分高于10 min以及15 min,这与宋宝坤等人在20 min处诱导产生较高的诱导率跟发眼率结果相似 [18] 。在本次双因素正交实验中结果显示,在起始时间为25 min处不同的处理方式同样会产生较高的诱导率跟发眼率。通过这两次实验可以说明,在起始时间20~25 min时进行热休克诱导虹鳟受精卵,可以产生较高的发眼率及诱导率。
5. 总结
在两次虹鳟三倍体诱导实验中,诱导效果较好的为以下两组:1) 虹鳟卵受精后20 min时,采用25℃处理20 min,产生的诱导效果为:发眼率为84.48%,诱导率为81.38%,综合评分为83.24%。2) 在虹鳟卵受精25 min时,采用25℃处理20 min,发眼率为70.00%,诱导率为88.89%,综合评分为77.56%。因此在虹鳟卵受精20~25 min时,采用25℃处理20 min的处理强度,可以得到较为理性的诱导效果,是较为理想的三倍体诱导参数。
基金项目
山东省农业良种工程项目(2016LZGC003)和山东省重点研发计划(产业关键技术)项目(2016CYJS04A01)资助。
参考文献
NOTES
*通讯作者。