1. 引言
区别于其他茶叶品种,黑茶经过独有的后发酵工艺,风味独特,保健功效卓越。六堡茶属于黑茶家族重要成员,得名于产区广西梧州市苍梧县六堡乡,其茶外形光润黑褐,汤色浓红,味醇甘爽,以“红、浓、陈、醇”著称。历史上民间以六堡茶防治多种病疾,调理身体,解渴除腻,消积养胃,其功能渐渐为消费者熟知,神秘面纱慢慢揭开。
黑茶中茶多糖(TPS)具有一定生理活性,如降低血脂血糖、增强免疫力、抗肿瘤、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗血栓、增加冠脉流量、减慢心率等,是黑茶主要活性物质之一 [1] [2] [3] 。
茶多糖易溶于热水,可以利用热水对茶多糖进行提取,通过对提取条件的优化,促进茶多糖从茶叶溶出。不同研究者对水浸提茶多糖的料液比、提取温度、浸提时间进行了研究,研究结果因茶叶品种和研究者不同而存在差异 [4] [5] [6] [7] 。利用正交试验法研究优化提取茶多糖条件存在实验次数过多,数值不能超过所选取范围水平等缺点,难免美中不足。本研究采用单因素试验研究六堡茶茶多糖的提取工艺,并通过二次响应面分析法优化,确定六堡茶茶多糖的提取工艺条件,克服了上述缺点。
2. 材料
六堡茶为梧州中茶茶业有限公司三年陈窖藏产品。
紫外分光光度计,日本岛津公司250IPC;电子分析天平,瑞士METTLER公司METTLER-XS205;80-2B台式离心机,上海精密仪器仪表有限公司产品。
所用试剂均为分析纯。
3. 方法
3.1. 茶多糖的制备
参考绿茶、普洱茶茶多糖提取方法 [5] [7] 略加修改,确定六堡茶茶多糖提取影响因子,利用热水浸提,过滤收集滤液,经旋转蒸发浓缩至初始体积1/5,添加3倍量无水乙醇,混合均匀静置过夜,离心(5000 r/min, 10 min)收集沉淀,用无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯先后各洗涤3次,得精制茶多糖。
茶多糖采用蒽酮–硫酸法进行含量测定 [8] ,按下式计算茶多糖提取率:
式中C供试液中的葡萄糖浓度(mg/mL);D多糖的稀释因素;f换算因子;W供试茶叶的重量(mg)。
3.2. 单因素试验
单因素试验设定三因素分别为料液比、提取温度、浸提时间。考察三因素对茶多糖提取率的影响。先固定提取温度为80℃,浸提时间90 min,提取1次,料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50;然后固定料液比1:20,浸提温度80℃,提取1次,浸提时间分别为30 min、60 min、80 min、90 min、120 min、140 min;最后固定液料比1:20,浸提时间90 min,提取1次,浸提温度分别为40℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。
3.3. 试验设计
根据Box-Behnken Design试验的设计原理,综合了单因素试验的结果分析,选取料液比(X1)、浸提温度(X2)、浸提时间(X3)三因素作为试验的自变量,茶多糖提取率作为响应值,并根据单因素试验的结果选定三因素的零水平和波动区。试验因素与水平的取值如下表1。
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Table 1. Factors and levers of response surface test
表1. 响应面因素水平编码表
3.4. 数据分析方法
每个实验进行3次重复,以茶多糖提取率为响应值进行统计。单因素结果采用EXCEL进行统计分析,响应面实验结果采用Design-Expert软件自带系统进行分析。
4. 结果与分析
4.1. 换算因子的测定
精密称取45℃真空干燥至恒重的精制茶多糖0.022 g,置于50 mL容量瓶中,加入蒸馏水并稀释至刻度,90℃水浴加热,超声波功率420 W条件下作用10 min助溶,摇匀,得茶多糖贮备液,采用蒽酮–硫酸比色法测定其吸光度(A)。使用回归方程求出此精制茶多糖贮备液中相对葡萄糖的含量,按下式计算其换算因子。取等量的10 mL浓缩液2份,经过醇沉洗涤后,一份直接加入蒸馏水,然后定容,比色,测定其多糖含量;另一份经过真空干燥至恒重,称得精制茶多糖的干重,由二者计算出的换算因子求平均值。
式中:W为称取茶多糖的重量(mg),C为精制茶多糖贮备液中葡萄糖浓度(mg/mL),D为多糖的稀释因素,换算因子见表2。
4.2. 单因素试验结果
4.2.1. 料液比对茶多糖提取率的影响
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Figure 1. Effects of ratio of material to water on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图1. 料液比对茶多糖提取率的影响
从图1可知,在1:10~1:50范围内,随着料液比的增大,茶多糖的得率缓慢上升,但从1:20开始茶多糖得率增长趋于平缓。料液比增大会增加能耗和操作成本,从实际生产效益考虑,料液比1:20左右较为适宜,故选取1:20为响应面分析法中自变量液料比(X1)为零水平。
4.2.2. 提取温度对茶多糖提取率的影响
提取温度对茶多糖提取率具有较大的影响,见图2,提取温度低于80℃时,随着温度的升高茶多糖的提取率逐渐升高,大于80℃后,茶多糖的提取率渐趋平衡。故选取80℃作为响应面分析法中自变量温度(X2)的零水平。
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Figure 2. Effects of extraction temperature on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图2. 提取温度对茶多糖提取率的影响
4.2.3. 提取时间对茶多糖提取率的影响
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Figure 3. Effects of extraction time on of extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图3. 提取时间对茶多糖提取率的影响
提取时间对茶多糖提取率的影响见图3,提取时间在30~90 min内,茶多糖的提取率随时间增加而升高,在90~140 min内,提取率提高速率减小,渐趋平衡。说明茶多糖的提取率跟时间有着密切关系,提取时间较短茶多糖溶出不充分;提取时间过长,茶多糖溶出充分,但其他水溶性杂质也容易游离出来,同时能源耗费也越多,多糖的最佳提取时间应在90 min左右,选取90 min作为自变量时间(X3)的零水平。
4.3. 响应面试验安排及试验结果
把试验点分为零点和析因点,零点为区域中心点,重复试验3次,供评估分析试验误差用;析因点包括自变量取值为X1、X2、X3所构成的三维顶点,为实验中选取的试验点;根据Box-Behnken的中心组合设计原理,设计三因素三水平总共15个试验点的响应面分析试验。
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Table 3. Test design and results of response surface analysis
表3. Box-Benhnken设计方案及试验结果
Box-Benhnken Design试验结果见表3所示,各个因素经过回归拟合后,试验因子对响应值的影响可以用回归方程表示,
,
其中Y为茶多糖提取率,A是液料比,B是提取温度,C是浸提时间。
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Table 4. Estimate value of partial regression coefficient of regress equation
表4. 回归模型系数及显著性检验结果
依据P值判断模型的显著性(P < 0.05显著,P < 0.001非常显著),显著性代表模型对各因素与茶多糖提取率相互关系可靠性的评价。由表4中可以看出,各因素中一次项X2与二次项X22为非常显著,对茶多糖提取率影响很大,X、X3、X12、X32的P值为显著,说明对茶多糖提取率的影响也较大,具有统计学意义。
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Table 5. Variance analysis of regression equation
表5. 回归方程方差分析表
从表5方差分析表可知,校正系数R2(adj) (0.9278 > 0.80),该模型只有7.22%的变异,说明模型拟合度较好,可以用来对实验研究进行分析和预测。
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Figure 4. Analysis of lack of fit on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图4. 茶多糖提取率残差分析图
对响应数据茶多糖提取率进行残差分析,残差值分析结果见图4,表明模型能在很大程度上解释观测数据中的变化。
根据回归方程作出响应面分析图和等高线图,见图5~7。
模型等高线和立体分析图非常直观地展现各个因子相互作用的影响,从图5~7可以看出,在所选的范围内回归模型存在最大值。浸提温度和液料比交互作用立体图曲线最陡峭,等高线的椭圆弧度最大,这说明了两者的交互作用效应最为显著。浸提时间和液料比交互作用立体图曲线较平滑,等高线趋于圆形,说明了交互最不明显。浸提温度和时间交互作用立体图曲线平滑,等高线趋于圆形,说明两者的交互不显著。运用Design-Expert软件的分析,得出最佳提取工艺为:液料比为1:17,浸提温度为83℃,浸提时间为93 min,理论预测茶多糖得率为7.77%。
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Figure 5. Response surface and contour plot for effects of the ratio of solvent to material and extraction temperature on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图5. 响应面法(液料比、温度)等高线图及立体分析图
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Figure 6. Response surface and contour plot for effects of the ratio of solvent to material and extraction time on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图6. 响应面分析法(液料比、时间)等高线图及立体分析图
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Figure 7. Response surface and contour plot for effects of extraction temperature and extraction time on extraction rate of Liupao Tea’s polysaccharide
图7. 响应面分析法(温度、时间)等高线及立体分析图
4.4. 验证试验
为验证模型在优化六堡茶茶多糖提取工艺的符合程度,回归方程优化提取条件下重复3次实验,比较了实验值和预测值的吻合程度,平均茶多糖的得率为7.8%,与理论值吻合程度比较好,说明回归方程和实际情况拟合较好,能够在实验中使用该模型。
5. 结论
依据单因素试验的结果,液料比在1:10~1:20,浸提温度在40℃~80℃,浸提时间为30~90 min时,六堡茶茶多糖提取率与工艺参数成正相关。基于试验设计软件采用响应面分析法优化提取参数,最佳的六堡茶茶多糖提取工艺参数料液比为1:17,浸提时间为93 min,浸提温度为83℃,理论预测值的茶多糖提取率为8.0%,实际试验值是7.8%。工艺条件与文献比较,略有差异 [7] [9] ,说明不同茶叶品种,最佳提取条件、提取率都会存在差异。利用响应面分析法对六堡茶茶多糖提取工艺进行优化,可以获得最佳工艺参数,进而能有效减少提取操作的盲目性,能为进一步的试验研究提供参考。
基金项目
《中茶窖藏六堡茶对高血糖血症的研究》/广西高校科学技术研究项目(KY2015ZD086)/钦州学院校级科研项目(2017KYQD223)。
NOTES
*通讯作者。