1. 引言
司法鉴定及案件排查中,Y染色体的STR检验已成为常规手段。Y染色体是呈父系遗传、单倍型及连锁遗传的染色体,为男性特有,在亲权鉴定及家系案件排查中发挥重要作用 [1] [2] [3] [4] 。目前,主流的Y-STR商品化检测试剂盒很多,如Yfiler (ABI)、Yfiler Plus (ABI)、DNATyper Y21 (公安部二所)、Powerplex Y23 (Promega)、AGCU Y24 (中德美联)等,但它们检测的基因座数目在17~27个之间,有的试剂盒引入了3~7个快速突变的基因座位点。而Y-STR快速突变的基因座的突变率过高,达到1 × 10−2以上,虽然在某种程度上提升了Y-STR的个体识别能力(Discrimination power, DP) [5] ,但是并不适合家系搜索,不利于刑侦案件的排查。而AGCU Database Y30试剂盒是由30个突变率低的Y-STR基因座位点组成的6色荧光复合扩增体系,低突变基因座组成的单倍型具有更好的家族谱系代表性,更加有利于Y-STR DNA数据库建设、案件侦破、法庭证据及亲权鉴定,降低了同系异型的风险 [6] [7] 。
本文根据SWGDAM和GA/T815-2009的具体要求,对AGCU Database Y30试剂盒的准确性、一致性、灵敏度、特异性、抗抑制性、同一性和混合样本进行检测评价。
2. 材料与方法
2.1. 样本
随机抽取本实验室日常案件的无关男性血液样本300份,无关女性血样20份,包括各类常见检材若干份,如血液痕迹、骨骼、唾液斑等DNA提取样本。购自农贸市场的猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼、鼠、兔血用于种属特异性检测。
2.2. 主要试剂与仪器
扩增试剂:AGCU Database Y30试剂盒;扩增仪:9700型PCR仪(美国ABI公司);遗传分析仪:3130xl遗传分析仪(美国ABI公司);DNA标准品:9948及007(男性DNA),9947A(女性DNA);血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂均使用sdH2O进行稀释。
2.3. 测试方法
2.3.1. 准确性与一致性测试
Control DNA 9948准确性测试:选取Database Y30试剂盒内的Control DNA 9948,根据试剂盒的说明要求,配制25 µL和10 µL扩增体系,进行三次平行检测,与说明书上的阳性分型进行比较。
样本一致性测试:选取20份无关男性样本,根据试剂盒的说明要求,用Database Y30进行检测;同样的20份无关男性样本,用AB公司的Y filer或Y filer plus试剂盒进行重复位点验证(10 µL扩增体系)。
2.3.2. 灵敏度测试
取Control DNA 9948和Control 007标准品,用超纯水分别稀释至1.0 ng/µL、0.5 ng/µL、0.25 ng/µL、0.125 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL,扩增体系为25 µL,每个浓度重复扩增三次,统计两种标准品各个基因座的检出情况。
2.3.3. 同一性测试
选取同一来源不同载体上的样本,如FTA血卡、FTA唾液卡、汗斑、毛发、肌肉组织、肋软骨等样本;根据试剂盒的说明要求,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其等位基因检出情况。
2.3.4. 稳定性测试
AGCU Database Y30试剂盒扩增前组份反复冻融5次和10次,对照组一直存放在−20˚C,根据试剂盒的说明要求,配制25 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析不同条件下,其分型结果有无明显差异。
2.3.5. 抗抑制测试
向标准品1 ng Control DNA 9948中加入选取的血红素、靛蓝、腐植酸、钙离子、血红蛋白和EDTA等抑制剂,制备模板(表1)。根据试剂盒的说明要求,配制25 µL扩增体系,分析其等位基因检出情况。
2.3.6. 特异性测试
种属特异性测试:选取猪、狗、牛、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA,按照Database Y30试剂盒说明书,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其有无出峰情况。
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Table 1. Concentration of inhibitor in template
表1. 模板中抑制物浓度
性别特异性测试:选取20例女性无关个体血样,用本实验室常用的提取试剂盒提取DNA;按照Database Y30试剂盒说明书,配制10 µL扩增体系,进行扩增、电泳检测,分析其有无出峰情况。
2.3.7. 混合样本测试
男/男混合样品测试:取Control DNA 9948与Control 007标准品,在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合,进行PCR扩增和DNA分型检测,每种混合比例进行三次平行试验。
男/女混合样品测试:取Control DNA 9948 (男性DNA)与Control 9947A (女性DNA)标准品,在两者浓度比1:1、1:4、1:9、1:19、1:29的比例混合,进行PCR扩增和DNA分型检测,每种混合比例进行三次平行试验。
2.3.8. PCR环境测试
分别采用10 μL、25 μL扩增体系,采用l×、2×引物量,对l ng Control DNA 9948标准品分别进行检验并重复3次;设置退火温度为56˚C、57˚C、58˚C、59˚C、60˚C、61˚C、62˚C、63˚C;热循环次数为29、30次,对同一样品分别进行检验并重复3次。
3. 测试结果
3.1. 准确性与一致性
以Control DNA 9948、滤纸、FTA卡为扩增模板,进行反复多次扩增,更换实验仪器,与对照比较,扩增效率无明显差异,分型结果稳定、图谱完整清晰,未见明显非特异性峰。与AmpFISTR®Yfiler plus®试剂盒在共有基因座上分型结果完全相同(图1),说明该试剂盒具有良好的准确性与一致性。
3.2. 灵敏度
将6种浓度的标准品9948和007分别检测,检验结果发现,当模板含量低至0.125 ng时,所有基因座的等位基因均能被检测到,如图2所示;而当模板含量降至0.10 ng时,D12S391、DYS635、DYS389II、DYS390、Y_GATA_H4和DYS392等六个基因座的等位基因峰高过低;进一步降低模板含量至0.05 ng时,AGCU Database Y30系统80%的等位基因未被检出。所以本试剂盒可有效检测样本的灵敏度为0.125 ng。
3.3. 同一性
实验结果发现,同一来源的血斑、唾液斑、汗液、毛发等样本DNA分型结果均具有同一性(图3),表明该试剂盒能够准确判断基因型。对不同的样本种类,如FTA卡(博坤)、FTA卡(国产)唾液卡、提取样本、Control DNA 9948均适用。
3.4. 稳定性
试剂盒成分稳定性测试发现,如图4所示,将试剂盒组分反复冻融10次,在第10次时进行PCR扩增及电泳检测,分析结果发现,不同载体样本(FTA卡与滤纸)与对照阳性比较,扩增效率无明显差异。
3.5. 抗抑制剂测试
通过抗抑制剂测试发现,当标准品加入浓度为50 μmol/L和75 μmol/L的血红素,仍可获得完整分型;血红素浓度大于75 μmol/L时,则只能获得部分基因座分型,且随着浓度增加,获得的基因座逐渐减少。相比其他试剂盒,本试剂对血红素具有较高的耐受性。扩增体系可耐受的抑制剂浓度见表2。
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Figure 1. The results of accuracy test (a): AGCU Database Y30 kit; (b): Yfiler Plus kit
图1. 准确性测试结果(a):AGCU Database Y30试剂盒;(b):Yfiler Plus试剂盒
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Figure 2. The results of sensitivity test (0.125 ng 9948)
图2. 灵敏度测试结果(0.125 ng 9948)
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Figure 3. The results of consistency test
图3. 同一性测试结果
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Figure 4. DNA profile of freeze-thaw 10 times
图4. 冻融10次的分型图谱
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Table 2. Inhibitor concentrations tolerance of AGCU Y30 kit
表2. 扩增试剂可耐受抑制剂浓度
3.6. 特异性
对本研究选择的样本如猪、牛、狗、猫、鸡、鸭、兔、鱼、鼠和大肠杆菌DNA进行检验,在分型范围内,除阳性对照,不出现特异的DNA分型。说明该试剂盒具有种属特异性。检测20例女性无关个体血样,结果发现无出峰情况(图5)。说明该试剂盒具有良好的性别特异性。
3.7. 混合样本检测效果
混合样本实验结果显示当模板总量为1.25 ng,Control DNA 9948与Control DNA 9947A及Control DNA 007的混合比例均为1:19时,能够准确检出ControlDNA 9948的每个基因座的基因分型。实验结果
(a)
(b)
(c)
Figure 5. The test result of specificity
图5. 特异性测试结果
如图6和图7所示。
3.8. PCR环境测试结果
扩增体系与引物量:不同体系扩增检测结果如图8所示,25 μL和10 μL扩增体系检测中,等位基因分型一致,未出现等位基因丢失及非特异性峰,峰高无明显差异。分别用1×、2×引物量进行扩增时,分型结果一致,未出现等位基因丢失及非特异性峰。
退火温度与循环次数:由结果可知,无论是以FTA卡还是滤纸为载体,59˚C退火温度下,扩增29个循环分型结果一致(如图9、图10)。63˚C时,等位基因分型出现不均衡现象,部分等位基因峰值低于100。
4. 讨论
综上对AGCU Database Y30试剂盒进行的技术指标及性能评价,结果证明,该试剂盒能够准确分型,且检出成功率高,在男女混合样本中(女:男 = 19:1)仍然能够准确检测分型,同时具有较好的种属特异性。并且该试剂盒符合DNA检测试剂的标准,可适用于不同检材。此外,由于采用直接扩增,可省去DNA提取部分,缩短操作时间,简化操作流程,并降低样品污染几率。
我们的法庭科学DNA数据库自建立以来,已在公安实际检案中发挥了重要作用。由于各类犯罪案件中,男性居多,在DNA数据库中增加男性家系的Y染色体的遗传特性及比对功能,将会进一步拓展DNA数据库的功能。Yfiler、Yfiler Plus、Powerplex Y23等试剂盒主要以欧美人为主进行基因座选择,而且加
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Figure 6. The test result of male/female mixture (9948: 9947A = 1:19)
图6. 男/女混合样本测试结果(9948: 9947A = 1:19)
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Figure 7. The test result of male/male mixture (9948:007 = 1:19)
图7. 男/男混合样本测试结果(9948:007 = 1:19)
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Figure 8. The test result of amplification system 25 μL and 10 μL
图8. 25 μL和10 μL扩增体系测试结果
入了3~7个快速突变的基因座位点 [8] 。快速突变的基因座在某种程度上提高了个体识别能力,以及同一父系遗传男性个体间的区分能力 [5] ,但是削弱了Y染色体遗传的应用价值。
本研究采用毛细管电泳的方式检测Y-STR位点,检测位点多,且简便易行;而新一代测序检测方式还未普及,测序繁琐且昂贵。AGCU Database Y30试剂盒采用六色荧光检测技术,实现了30个Y-STR基因座在同一管内的复合扩增、检测。筛选了中国人群的低突变率的基因座,其单倍型具有更好的家族谱系代表性,更加有利于中国人群的Y-STR DNA数据库建设及案件侦破 [9] 。Database Y30试剂盒中,各基因座的分布及荧光标记类型见表3。分型标准物(Allelic Ladder)包括了中国人群Y-STR中常见的等位基因,检测结果见图11。由图11可见,各位点分型清晰,且峰高均衡。综上,本文测试结果证明,AGCU
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Figure 9. DNA profile of FTA card in 59˚C
图9. FTA卡在59˚C退火温度下的分型
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Figure 10. DNA profile of FTA card in 63˚C
图10. FTA卡在63˚C退火温度下的分型图谱
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Figure 11. Detection map of allelic ladder using Database Y30 kit
图11. Database Y30试剂盒中分型标准物(Allelic Ladder)检测结果
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Table 3. The loci distribution of Database Y30 kit
表3. Database Y30试剂盒中基因座分布
Database Y30试剂盒在Y染色体数据库建设及实际案件排查中具有良好的应用前景。