1. 引言
铜元素在微量元素中占据重要地位,长期食用含铜量较高的食物会伤害人体的健康。人口服硫酸铜致死量约为10 g。大量调查研究显示,Cu的毒性受其形态影响,游离的Cu2+拥有更强的毒性,对生物体的破坏更大。在实验室,常用的Cu2+检测方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子发射光谱法、分光光度法等 [1] [2] [3] [4] ,这些检测方法不适宜应用于食药环案件现场的快速检测。因此,研究一种能适用于食药环案件现场快速检测食品或水中Cu2+的方法是很有必要的。
纳米金颗粒(AuNPs)在可见光区具有很高的稳定性以及良好的生物相容性,任何表面结构的改变、聚集,或解职折射率的改变可能都会改变其分散性,最终导致颜色变化,成为最常用的光学传感材料。本论文主要以AuNPs为基础与木瓜蛋白酶合成功能化纳米金,寻找反应的最佳条件,建立木瓜蛋白酶-AuNPs快速检测Cu2+方法,该方法操作简便,灵敏度高,能应用于食药环案件现场快速检测食品或水中Cu2+。
2. 材料与方法
2.1. 仪器设备
UV/VIS Lambda 25紫外–可见分光光度计,美国PerkinElmer公司;
JEOL-2100透射电镜,日本电子公司;
85-2型恒温磁力搅拌器,上海司乐仪器有限公司;
超声波清洗器,上海金棋实业公司;
十万分之一电子天平,德国赛多利斯公司。
2.2. 试剂及溶液配制
铜标准溶液(G62024-90) 1 mg∙mL−1 (10% HCl);木瓜蛋白酶(含量不少于98.5%阿拉丁试剂公司);氯金酸(分析纯,上海试剂一厂),柠檬酸三钠(分析纯,南京化学试剂厂)。
称取木瓜蛋白酶0.0220 g用100 mL容量瓶定溶配置成0.22 mg∙mL−1的木瓜蛋白酶溶液。
氯金酸称得0.9280克于棕色容量瓶中配成100 mL溶液,置内避光存放。
柠檬酸三钠配成质量分数为1%的溶液。
精确移取1.00 mL铜标准溶液于100 mL容量瓶中,加二次蒸馏水稀释至刻度,配成0.0100 mg∙mL−1母液。
3. 实验内容
3.1. 纳米金的合成和表征
纳米金制备 [5] [6] [7] [8] :移取2.00 mL 1%的氯金酸至装有100 mL水和磁石的烧杯中,将烧杯置于磁力加热搅拌器上加热至沸腾,开动磁力搅拌器搅拌的同时迅速加入4 mL 1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些变黑,经过一段时间,变蓝,再加热出现红色。煮沸两到三分钟后,出现透明的酒红色,继续加热搅拌至5分钟,移去热源同时停止搅拌。冷却至室温,避光保存即得胶体金溶液。
用紫外可见光谱仪在400~700 nm波长范围表征纳米金溶液,并考察其稳定性。
用透射电子显微镜测定表征上述溶液中纳米金颗粒度。
3.2. 功能化纳米金的合成和表征
精确移取4 mL的柠檬酸钠溶液分别加入到含有1,2,4 mL的木瓜蛋白酶溶液的试管中并且充分振荡;移取2 mL 1%的氯金酸至装有100 mL水和磁石的250 mL的烧杯内,将烧杯置于磁力搅拌器上加热至沸腾,迅速加入柠檬酸钠和木瓜蛋白酶混合溶液。半分钟后溶液开始由无色透明变黑,变紫接着变蓝,煮沸2~3分钟后出现透明酒红色,继续加热搅拌数分钟至5分钟移去热源,同时停止搅拌,冷却至室温后转移到棕色试剂瓶中避光保存,即胶体金溶液,用紫外可见分光光光度计检测,选择最佳配比;用透射电子显微镜表征功能化纳米金的颗粒度。
3.3. 水中铜离子的测定
3.3.1. 吸收光谱法检测铜离子 [9]
Cu2+标准曲线的制备:在1 mL木瓜蛋白酶-AuNPs溶液,分别加入1 mL 1.0、2.5、5.0、7.5、8.0 μg∙mL−1的硝酸铜溶液,充分混合后,用紫外分光光度计测量其吸光度,建立标准曲线。
3.3.2. 应用
取可疑铜污染水质的检材1 mL,加入1 mL木瓜蛋白酶-AuNPs溶液,充分混合后,用紫外分光光度计测量其吸光度,并计算水中铜离子的浓度。
4. 结果与讨论
4.1. 纳米金的合成与表征
按照2.1制备纳米金溶液,得到酒红色溶液,并考察了氯酸金与柠檬酸三钠的配比,见图1。图中样品1.1是氯金酸与柠檬酸三钠的比值为1:1时合成的1%的AuNPs溶液,样品1.2是氯金酸与柠檬酸三钠的比值为1:2时合成的1%的AuNPs溶液。实验结果表明,合成AuNPs溶液氯金酸与柠檬酸三钠的最佳比例为1:2,此时特征峰为520.07 nm。
在最佳比例条件下合成纳米金溶液的颗粒度在透射电镜下检测,其结果见图2。
由图2可以看出制备的纳米金颗粒大小在10~15 nm之间,分离度较好。
将合成的纳米金溶液在棕色瓶中放置6个月后,测定其可见区的吸收光谱,并与之前的吸收光谱比较,考察了该纳米金溶液的稳定性。
由图3可以知道所合成的纳米金溶液在半年前后的最大吸收峰的波长不变,只是吸光度略微减小,因此,纳米金溶液在避光保存的条件下稳定性较好,可以长期保存。
4.2. 功能化纳米金的制备与表征
采用木瓜蛋白酶为功能化试剂,制备功能化纳米金。通过调整氯金酸和木瓜蛋白酶的加入比值,选
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x9_hanspub.png)
Figure 1. Chlorauric acid and citric acid three sodium and ratio spectra
图1. 氯金酸和柠檬酸三钠比例不同时的光谱图
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x10_hanspub.png)
Figure 2. Determination of nanoscale gold transmission electron microscopy
图2. 纳米金透射电子显微镜测定表征
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x11_hanspub.png)
Figure 3. Stability comparison of nanoscale gold solution before and after half a year
图3. 纳米金溶液半年前后稳定性比较
择其最佳配比,用紫外可见吸收光谱表征实验结果,见图4。
由图4可以看出氯酸金与木瓜蛋白酶的比例不同,其最大吸收峰和吸光度都会发生变化,具体数据见表1。
实验结果表明,氯金酸与木瓜蛋白酶比例为1:2合成的木瓜蛋白酶-AuNPs溶液吸光度最高,为最佳比例。
透射电镜表征上述制备的功能化纳米金,结果见图5。
1:2合成的AuNPs-木瓜蛋白酶的颗粒基本呈圆形,粒度在10~20之间,尺寸分别较均匀。
4.3. 功能化纳米金测定Cu2+
4.3.1. 功能化纳米金测定铜离子的标准曲线
为了考察木瓜蛋白酶-AuNPs快速检测Cu2+离子的适用性,在上述优化条件下,在木瓜蛋白酶-AuNPs溶液中加入不同浓度Cu2+离子反应两分钟,结果发现无Cu2+离子存在时,溶液保持红色不变,随Cu2+离子浓度增加,溶液逐渐由红色变为蓝紫色。且在521 nm处的吸光度逐渐降低。体系对不同浓度Cu2+离子的响应表明,木瓜蛋白酶-AuNPs溶液在521 nm处的吸光度减去和不同浓度Cu2+离子反应后的溶液在521 nm处的吸光度即为 A521(y)与Cu2+离子浓度(x, μg∙mL−1)成良好的线性关系,标准曲线见图6。
实验结果得到,其线性方程为:y = 150.48x − 0.0514,R2 = 0.9978,线性范围0.5~25 μg∙mL−1。
4.3.2. 功能化纳米金木瓜蛋白酶测定铜离子的精确度和检出限
在同样条件下,取三份1 mL 5.0 μg∙mL−1铜溶液分别加入1 mL木瓜蛋白酶-AuNPs溶液,按照本方法进行测定,计算得出,其相对标准偏差(RSD, n = 3)为2.36%,如图7所示。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. Characteristic peaks and absorbance of different proportions of chloric acid and papain
表1. 氯酸金与木瓜蛋白酶不同比例的特征峰和吸光度
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x12_hanspub.png)
Figure 4. Spectrogram of different proportions of chloro auric acid and papain
图4. 氯金酸和木瓜蛋白酶比例不同时的光谱图
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x13_hanspub.png)
Figure 5. Functionalized nanoparticles of nanoscale papain
图5. 功能化纳米金木瓜蛋白酶的颗粒
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x14_hanspub.png)
Figure 6. Standard curve for determination of copper ion concentration by functionalized nano gold papain
图6. 功能化纳米金木瓜蛋白酶测定铜离子浓度的标准曲线
![](//html.hanspub.org/file/4-1560137x15_hanspub.png)
Figure 7. Spectrographic determination of the accuracy of papain AuNPs solution
图7. 木瓜蛋白酶-AuNPs溶液精确度测定光谱图
取不同浓度的铜标准溶液分别加入1 mL木瓜蛋白酶-AuNPs溶液中。经过紫外分光光度计测定,木瓜蛋白酶-AuNPs检测Cu(Ⅱ)的检出限(3 S/N)为0.3 μg∙mL−1。
4.4. 方法应用
取可疑铜污染水质的检材1 mL,加入1 mL木瓜蛋白酶-AuNPs溶液中。经紫外分光光度计测定,测得其在521 nm处的吸光度为0.7931 A,木瓜蛋白酶-AuNPs溶液在521 nm处的吸光度减去其在521 nm处的吸光度,并将其代入其线性方程为:y = 150.48x − 0.0514,R2 = 0.9978,测得其铜离子浓度为4.4 μg∙mL−1。
5. 结论
基于Cu2+离子能够引起含巯基(-SH)的木瓜蛋白酶-AuNPs溶液相互形成Cu-S键,诱导纳米金发生团聚导致溶液颜色发生变化,实现了水中Cu2+的比色检测,其检出限为0.3 μg∙mL−1;同时该方法具有简单的、成本低、效益高和快速比色法检测Cu2+离子等优点。因此,在水环境中Cu2+的检测方面具有很好的应用前景。
基金项目
江苏警官学院重点项目,项目编号:201610329004Z;江苏警官学院《物证分析新技术》创新团队2015SJYTZ02;江苏省“十三五”一级学科省重点建设学科资助项目;江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。