1. 引言
橄榄又名福果、青果等,是橄榄科橄榄属植物的果实,栽植面积广,产率高,是一种很容易购买到的食材,具有很大的发展潜力 [1] 。橄榄果肉拥有丰富的营养价值,含钙量高而且容易被人体所吸收,可以通过开发和利用成为药品或者保健品;橄榄还有很高的药用价值,药用橄榄对降血压、血糖、血脂、糖尿病、咽喉肿痛、口腔溃疡、咳嗽、哮喘等病症有明显疗效 [2] 。
抗氧化剂目前广泛应用于食品加工,自然界中许多植物中的天然抗氧化成分因其安全、健康、无毒而得到人们越来越多的关注。而橄榄多酚作为一种自然抗氧化剂,是一种广泛存在与植物体内的多元酚,主要分布于物的皮、根、木、叶、果中,它也是一类具有独特生理活性和药理活性的天然产物。大量研究表明,橄榄多酚在抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老、抗氧化等很多方面具有良好的作用,具有很高的发展前景 [3] 。
DPPH自由基在517 nm波长附近存在最大吸收峰 [4] 。DPPH自由基和抗氧化剂反应后,抗氧化剂可以配对DPPH的孤对电子对使DPPH褪色,接受电子量与褪色程度呈定量关系,所以可用比色定量分析来测定橄榄多酚溶液的抗氧化能力,DPPH清除率越大,抗氧化能力越强 [5] 。因为该方法简单、快捷、灵敏,操作方便,所以本论文使用DPPH消除法来测定橄榄多酚的抗氧化性,并使用Vc和BHA这两种常用食品添加剂作为对比,反映橄榄多酚还原能力的强弱。
由于提取抗氧化剂的原材料不同,抗氧化剂可以采取多种提取方法。常用的有超声辅助提取法、微波辅助提取法、酸碱提取法、酶解法、醇浸法等 [6] 。罗永会等 [7] 用传统乙醇浸取橄榄多酚,有较好的提取率5.75%,但是耗时达到4 h。曾培源等 [8] 用超声提取橄榄多酚,工艺流程需要3次,每次40 min,得率2.3%。何志勇等 [9] 用微波提取,时间仅需5 s,得率1.2%。传统提取法消耗时间但提取率较高,现代提取法省时但提取率较低。
多酚类化合物在碱性溶液中,钨钼酸与体系中存在的酚羟基发生反应,钨离子从正六价转换为正五价,导致反应体系从青绿色转换为蓝色,溶液中蓝色的深浅程度与含酚基团的数目成正比,所以可以利用紫外/可见分光光度计测量溶液的吸光度,从而求得多酚的提取率 [10] 。
二次正交旋转组合设计是国外近年应用较多的一种实验设计方法。结合了响应面优化法,并且通过统计软件对实验结果进行非线性数学模型拟合。
该论文首先对超声时间、超声水浴温度、乙醇浓度、固液比四个因素分别进行单因素实验,研究这四个因素对橄榄多酚提取率的影响,得到各个因素的最佳条件所在的大致范围。再利用二次正交旋转组合设计,以单因素实验中各个因素的最佳条件作为中心水平,进行四因素五水平的正交实验设计,最终得到最佳的工艺参数。
2. 材料与方法
2.1. 仪器和试剂
橄榄粉(云南文山一缘药业),DPPH(西亚试剂),福林酚(广东光华科技股份有限公司)(阿拉丁),真空冷冻干燥机(上海比朗仪器制造有限公司),UV-1100紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司),TENSOR27傅立叶变换红外光谱(德国布鲁克公司)等。
2.2. 实验方法
2.2.1. 实验步骤
1) 用电子天平称取3 g橄榄干粉于250 mL锥形瓶中,加入指定乙醇浓度与固液比的乙醇溶液,混合均匀后将其放置于常温下的单槽式超声波清洗机(功率300 W)中,进行超声协同提取。提取一段时间后,通过纱布过滤后,将溶液离心后除去沉淀即初提取液。
2) 取1 mL初提取液稀释并定容到50 mL容量瓶,剩余提取液样品放置于冰箱保存待用。取1 mL样品于50 mL容量瓶中,滴加1.5 mL福林酚和10 mL去离子水,于避光处放置5 min后,加入6 mL的10%碳酸钠溶液,静置60 min反应过,在765 nm波长下测定吸光度,以焦性没食子酸为标量计算提取液中的多酚含量。
3) 将储存待用的提取液装入500 mL四口烧瓶中,通过水浴加热蒸出残留在提取液中的乙醇,得到脱醇溶液,装盘后放入冷冻箱结冰,次日放入冷冻干燥机进行脱水处理,得到橄榄多酚干粉。
4) 将干粉溶解于溶液中,稀释处理后,进行DPPH自由基消除能力、羟基自由基消除能力等抗氧化功能的测定。
2.2.2. 没食子酸标准曲线
1) 用电子天平准确称取焦性没食子酸0.0507 g,用蒸馏水溶解,定容至100 mL容量瓶备用,作为没食子酸标准液。
2) 用天平量取10 g无水碳酸钠固体,加入60 mL蒸馏水溶解,将碳酸钠溶液转移到容量瓶,用少量蒸馏水分别清洗烧杯三次,残液转移至容量瓶,定容,得到10% Na2CO3溶液。
3) 吸取3.0 mL、6.0 mL、9.0 mL、12.0 mL、15.0 mL没食子酸标准液分别定容于50 mL容量瓶内。然后从没食子酸系列梯度溶液中吸取1.0 mL溶液加入25 mL容量瓶中,加入10 mL蒸馏水摇匀,用移液管移取1.50 mL福林酚试剂,摇匀后放置在黑暗处,5 min后加入6 mL 10% Na2CO3溶液摇匀,然后在室温下避光放置反应60 min,以蒸馏水作参比,在波长765 nm处测定其吸光值。以吸光值为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线 [11] 。
2.2.3. 单因素实验
1) 超声时间对橄榄多酚提取率的影响
取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中,加入65%乙醇100 mL (65 mL乙醇 + 35 mL蒸馏水),在50℃的超声水浴中加热30 min、40 min、50 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。
2) 提取温度对橄榄多酚提取率的影响
取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中,加入65%乙醇100 Ml (65 mL乙醇 + 35 mL蒸馏水),分别在40℃50℃、60℃、70℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。
3) 乙醇浓度对橄榄多酚提取率的影响
取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中,分别加入35%、45%、55%、65%乙醇100 mL。分别在50℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。
4) 料液比对橄榄多酚提取率的影响
取3 g橄榄粉于250 mL锥形瓶中,分别加入65%的45 mL、60 mL、75 mL、90 mL的乙醇,分别在50℃下反应40 min。用福林酚作显色剂测其吸光度。
2.2.4. 二次正交旋转组合实验
由以上四个单因素实验可知,该四个因素均对提取率有较大影响,分别为:超声时间、温度、乙醇浓度、料液比,其中超声虽然随着时间增加产率仅有少量提升,出于实际生产效率仍选择40 min为中间水平。二次正交旋转组合实验设计分别使用−2,−1,0,1,2表示每个因素的5个水平,如表1。以橄榄多酚的提取率为目标,运用数据处理软件SAS得出,整个实验有36组,设计如表2,以优化橄榄多酚提取的最佳工艺条件 [12] 。
2.2.5. 用红外吸收光谱鉴定提取物成分
将冷冻干燥获得的橄榄多酚提取物干粉加入溴化钾研磨均匀成粉,取适量样品进行压片,得到薄膜片放入样品架在4000~400波数进行红外吸收光谱测量。
2.2.6. 橄榄多酚对DPPH消除率的测定
1) 1 m mol∙L−1 DPPH溶液的制备
用分析天平准确量取19.716 mg的DPPH固体定容于50 mL棕色瓶中,定容可得到1 m mol∙L−1的DPPH溶液。使用时需稀释10倍使用。
2) 橄榄提取物系列浓度梯度溶液制备
取0.25 g橄榄多酚提取物用无水乙醇定容于100 mL容量瓶,得到2.5 mg∙mL−1原液①。从原液①中量取2 mL橄榄溶液定容于50 mL容量瓶,得到0.1 mg∙mL−1溶液②。从溶液②中取10 mL溶液定容于50 mL容量瓶,得到0.02 mg∙mL−1溶液③。从溶液②中取5 mL定容于50 mL容量瓶中,得到0.01 mg∙mL−1溶液④。从溶液②中取2.5 mL定容于50 mL容量瓶中,得到0.005 mg∙mL−1溶液⑤。从溶液②中取0.5 mL定容于50 mL容量瓶中,得到0.001 mg∙mL−1溶液⑥。以上制备得到0.1 mg∙mL−1、0.02 mg∙mL−1、0.01 mg∙mL−1、0.005 mg∙mL−1、0.001 mg∙mL−1系列浓度梯度溶液。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. Combination experiment design of quadratic regression orthogonal
表1. 二次正交旋转组合实验设计表
3) 橄榄多酚对DPPH清除率的测定
分别用移液管移取0.1 mg∙mL−1、0.02 mg∙mL−1、0.01 mg∙mL−1、0.005 mg∙mL−1、0.001 mg∙mL−1的橄榄多酚溶液2.0 mL至试管中,分别加入2.0 mL乙醇和2.0 mL 0.1 m mol∙L−1的DPPH溶液,另外取一直空试管加入2 mL蒸馏水和2 mL 0.1 mmol∙L−1的DPPH溶液,作为空白样使用。将这一系列试管摇晃均匀后放置于黑暗处静置30 min,在波长517 nm处测定吸光度。用Vc作为参照,计算DPPH清除率。
(1)
其中,Ax为加入样品和DPPH溶液反应后的吸光度;Ay为加入样品和等体积乙醇溶液的吸光度;A0为空白对照样的吸光度。
4) Vc、BHA对DPPH清除率的测定
分别制备Vc、BHA系列浓度梯度溶液,得到0.1 mg∙mL−1、0.02 mg∙mL−1、0.01 mg∙mL−1、0.005 mg∙mL−1、0.001 mg∙mL−1的Vc溶液和BHA溶液。分别移取各样品溶液2.0 mL至试管中,分别加入2.0 mL乙醇和2.0 mL 0.1 m mol∙L−1的DPPH溶液,另外取一直空试管加入2 mL蒸馏水和2 mL 0.1 m mol∙L−1的DPPH溶液,作为空白样使用。将这一系列试管摇晃均匀后放置于黑暗处静置30 min,在波长517 nm处测定吸光度 [13] 。
2.2.7. 二次回归正交旋转组合设计实验
二次回归正交旋转组合设计实验用spss软件进行方差分析和显著性检测进行分析后,再用sas软件拟合二次回归正交优化方程,最后matlab软件对提取因素间的交互作用进行分析。
3. 结果与分析
3.1. 福林酚测定没食子酸浓度标准曲线
据步骤2.2.2.得回归方程y = 10.028x − 0.0355,R2 = 0.99862,表明在0.02~0.12 mg∙mL−1的浓度范围内,没食子酸浓度x与吸光度y之间有很好的相关性,如图1所示:
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Figure 1. The standard curve of gallic acid
图1. 没食子酸标准曲线
3.2. 单因素实验结果
3.2.1. 超声时间对橄榄多酚提取率的影响
由图2可知,在40 min内,随着超声提取时间的增长,多酚得率逐渐增大,当超声时间延长到40 min以后,多酚得率稍微下降,随着时间增长,得率只有不显著的增长,在实际生产中,40 min的生产效率更高,故选择超声提取时间为40 min。
3.2.2. 温度对橄榄多酚提取率的影响
由图3可知,在40℃到70℃的范围内,水浴温度对多酚得率有一定的影响,且在70℃左右到达最
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Figure 2. Effect of ultrasonic time on yield of oleuropein
图2. 超声提取时间对橄榄多酚得率的影响
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Figure 3. Effect of water bath temperature on yield of oleuropein
图3. 水浴温度对橄榄多酚提取率的影响
高点,故使用70℃水浴温度为最佳实验条件。
3.2.3. 乙醇浓度对橄榄多酚提取率的影响
由图4可知,在35%到65%的范围内,多酚得率随着浓度增加,呈先增加而降低的趋势。乙醇浓度对在55%范围内,随着百分数的增加,多酚得率增加,在55%的时候达到最高点,之后缓慢下降,故选择乙醇浓度55%为实验最佳条件。
3.2.4. 料液比对橄榄多酚提取率的影响
由图5可知,在1:20到1:30的范围内,随着乙醇用量的增加,多酚得率增加,到1:30时,多酚得
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Figure 4. Effect of ethanol concentration on yield of oleuropein
图4. 乙醇浓度对橄榄多酚得率的影响
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Figure 5. Effect of solid-liquid ratio on yield of oleuropein
图5. 料液比对橄榄多酚得率的影响
率达到最高点,之后有明显下降,故选择1:30为最佳条件 [14] 。
3.3. 二次回归正交旋转实验优化提取条件
由表2的实验结果,运用spss软件进行方差分析和显著性检测。由表3方差分析可知,模型整体sig值为0.012远小于0.05但接近于0.01,可见模型的显著性一般,其决定系数R2 = 0.790,说明模型拟合效果一般,实验存在一定的误差率。
由表3可见sig值小于0.05的项,x1远小于0.01,为主要影响显著的因素,x2和x3小于0.05,为显著性一般的因素,故影响因素主效应的顺序为x1 (超声时间) > x3 (乙醇浓度) > x2 (温度) > x4 (固液比)。从交互项来看,温度和乙醇浓度的交互作用、温度和固液比的交互作用均接近0.2,为交互项中最为显著的两项,可以想到因为温度的提高使乙醇溶液蒸发导致提取液的体积变小,影响到乙醇浓度和固液比两个因素对提取率的作用,所以乙醇浓度和固液比两个因素与其他因素的交互性的显著性较低。特别是体积减小影响最大的固液比显著性最低,导致了整体误差的增大。
显著性低的交互项去掉,使用sas软件拟合方程:
(2)
使用matlab软件对乙醇浓度、温度和固液比制作交互图。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Design of quadratic regression orthogonal rotation combination experiment
表2. 二次回归正交旋转组合实验设计表
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 3. Analysis of variance and significance test
表3. 方差分析与显著性检测
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Figure 6. The Interaction between extraction temperature and ethanol concentration
图6. 提取温度和乙醇浓度交互图
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Figure 7. The Interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio
图7. 提取温度和固液比交互图
由图6~图8可知,当响应面的坡度趋向平滑时,说明响应值受各个变量的影响较小;当响应面趋向倾斜时,则说明响应面受变量交互作用较为明显。通过比较图6~图8比较可知,温度、乙醇浓度和固液比这三个因素之间交互关系一般 [15] [16] [17] [18] 。
通过回归拟合方程分析出橄榄多酚最佳工艺参数为:超声时间37.3 min、水浴温度46.36℃、乙醇浓度为43.24%,固液比为1:32.5。考虑操作方便,修正最佳工艺为:超声时间37 min、水浴温度46℃、乙醇浓度为43%,固液比为1:32,在此条件下平行验证三次,实验结果为13.87%、13.92%、13.97%,平均值接近13.92%。
3.4. 红外吸收光谱
从图9的光谱图中可以看到,在3409.19 cm−1波长处,有一个较强的吸收峰,可能是由于-OH的伸缩振动造成;而在2975~2850 cm−1处弱的吸收峰为C-H的伸缩振动。在1034.14 cm−1处为C-H3的弯曲振
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Figure 8. The Interaction between ethanol concentration and solid-liquid ratio
图8. 乙醇浓度和固液比交互图
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Figure 9. The Fourier infrared spectrogram of oleuropein
图9. 橄榄多酚的傅里叶红外光谱图
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Figure 10. Comparison of the DPPH radical scavenging rate with oleuropeins, Vc and BHA
图10. 橄榄多酚、Vc、BHA对DPPH自由基的消除率对比图
动。在1450.77 cm−1处为C-H的弯曲振动。在1332.3 cm−1处为O-H的弯曲振动。可以得知,提取物成分存在酚类物质 [19] 。
3.5. 橄榄多酚抗氧化测定结果与分析
由图10中可知,在实验范围内,橄榄多酚的对DPPH清除能力处于Vc和BHA之间,不同浓度的橄榄多酚溶液对DPPH的清除率随浓度升高而增加。在低浓度范围内,清除率和质量浓度有明显的正相关性,随着浓度升高,消除率趋于平缓,逐渐趋近于96%。虽然橄榄多酚对DPPH自由基的消除率相对于Vc略低,但是它在高浓度时仍有效果,当质量浓度为0.1 mg∙m−1 L时,VC的消除率为98%,橄榄多酚的消除率大约为96.7%,BHA的消除率为94.7%,橄榄多酚的消除率介于这两种食品添加剂之间,可见橄榄多酚对DPPH消除效果显著 [20] 。
4. 结论
本文采用了超声辅助提取橄榄多酚的工艺,通过单因素和二次回归旋转正交试验的方法,确定了提取橄榄多酚工艺的最佳条件,即超声时间37 min、水浴温度46℃、乙醇浓度为43%,固液比为1:32。从影响提取率的因素来看,超声时间越长,提取率虽然有所增加但是逐渐趋近于平缓,在实际制作工艺过程中会使得成本增加,故应取提取率效率最高的超声时间。同时也并不是水浴温度越高,固液比越高,乙醇浓度越高,橄榄多酚的提取率就越高。故达到最佳条件附近时,橄榄多酚的提取达到饱和。
橄榄多酚对DPPH溶液的消除效果很高,介于Vc和BHA这两种公用食品添加剂中间,可见橄榄多酚作为抗氧化剂有较为显著的效果。因为温度上升,导致液体体积下降,乙醇浓度变化,所以温度和溶液体积、乙醇浓度的交互作用比较难以控制,导致了模型显著性的减低,如果使用更好的密封装置,可以使模型显著性更高,模型的公信力越强。
基金项目
2017年佛山科学技术学院省级大学生创新创业项目编号(201711847115)。
NOTES
*通讯作者。