1. 引言
石榴是石榴科Punicaceaes石榴属Punica L.植物,品种分类较多,石榴原产伊朗、阿富汗等中亚地区,相传为西汉张骞出使西域时引进中国,目前主要分布于陕西、山东、安徽、四川、云南、新疆等地 [1] 。石榴皮是《中国药典》收载的品种 [2] ,《本草纲目》记载:“石榴皮主蛔虫”,中医认为,石榴味甘、酸、涩,性温,归肺、肾和大肠经,具有生津止渴、收敛止泻、止血、杀虫和解酒等功效,石榴皮具有涩肠止泻、抗病毒、抗氧化、抑菌、驱虫等功能 [3] 。临床上石榴皮煎剂可治疗痢疾和腹泻,浸剂可治疗结肠炎和胃痛等。石榴皮中含有黄酮、多酚、鞣质、有机酸等多类化合物 [4] [5] ,总黄酮是其主要有效成分之一 [6] 。本文采用紫外分光光度法测定了不同品种石榴皮中总黄酮的含量。
2. 仪器和试剂
1) 四个不同品种的石榴样品购自云南省蒙自市当地农贸市场。
2) 仪器为紫外–可见分光光度计(TU1810,北京普析),超声提取器(SK3200H,上海仪器制造厂),电热鼓风干燥器(101-1AB型,天津市泰斯特仪器有限公司),芦丁对照品(自制,经HPLC检测纯度达到98%),其他试剂为分析纯。
3) 供试品溶液制备:将新鲜石榴的皮剥下,洗干净后剪小,置于电热鼓风干燥箱中70度加热干燥12小时,粉碎后过100目筛,备用。
4) 对照品溶液制备:精密称量9.7 mg的芦丁对照品于25 mL的容量瓶中,用乙醇溶解后定容,得到浓度为0.3880 mg/ml的对照品溶液。
3. 实验方法与结果
3.1. 提取条件优化
3.1.1. 乙醇体积分数对提取率的影响
精密称取石榴皮粉末三份各1 g,精密称定后放入100 ml容量瓶中,将提取的料液比(g/ml)固定为1:20,超声时间固定为2 h,设定不同体积分数的溶剂:50%乙醇、60%乙醇、70%,80%乙醇,加入提取溶剂,提取完成后分别用不同体积分数的溶剂定容,过滤后精密量取1 ml,用溶剂定容到50 ml,于360 mm波长处测定吸收度,结果见图1,可见60%乙醇的提取效果最好。
3.1.2. 料液比对提取率的影响
固定60%乙醇浓度、提取时间2 h,考察料液比为:1:10,1:15,1:20,1:25对提取率的影响,提取及处理过程同2.1.1,测定结果见图2。可见1:20的料液比提取效果最好。
3.1.3. 超声时间对提取率的影响
固定提取溶剂为60%的乙醇溶液,料液比为1:20,通过改变超声的提取时间来考察时间对提取率的影响,时间定为:1 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h,提取及处理过程同2.1.1,测定结果见图3。可见2 h的超声时间提取效果最好。
![](//html.hanspub.org/file/3-1710138x10_hanspub.png)
Figure 1. The effect of ethanol volume fraction on extraction rate
图1. 乙醇体积分数对提取率的影响
![](//html.hanspub.org/file/3-1710138x11_hanspub.png)
Figure 2. The effect of feed liquid ratio on extraction rate
图2. 料液比对提取率的影响
![](//html.hanspub.org/file/3-1710138x12_hanspub.png)
Figure 3. The effect of ultrasonic time on extraction rate
图3. 超声时间对提取率的影响
3.1.4. 正交试验设计
通过以上单因素实验,确定了最好的超声提取单因素试验条件,由于各因素间存在交互作用,单因素试验不能全面的反应各因素间的相互作用,所以选择正交试验来考察各因素对提取率的影响,采用三因素三水平的L9 (33)超声提取正交试验,确定最佳提取条件参数。因素水平见表1。
3.1.5. 正交试验结果及分析
L9 (33)正交试验中各因素和水平组建的9种组合方式、试验结果及分析见表2和表3,因为称取相同重量的样品,所以用吸收度代替提取率。
从表2可以看出,最佳工艺组合是A2B2C3,对极差贡献最大的是C因素,其次是A因素,B因素影响最小。可见料液比在提取过程中有重要作用。
3.2. 方法学讨论
3.2.1. 线性关系考察
取1.4配制的0.3880 mg/ml的对照品溶液,分别精密吸取1.0,1.6,2.0,3.0,4.0和5.0 ml于50 ml容量瓶中,用乙醇稀释至刻度,在360 nm波长处测定吸收度(A),以吸收度为纵坐标(Y),浓度(μg/ml)为横坐标(X),得到线性回归方程:Y = 0.0226X − 0.0374,相关系数r = 0.9978,n = 6,表明总黄酮在7.76~38.80 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。
3.2.2. 精密度试验
取对照品溶液,适当稀释后,于360 nm波长处测定吸收度,平行测定5份,由测得的吸收度计算
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Orthogonal test analysis table
表2. 正交试验直观分析表
从方差分析的结果看,A、B、C三个因素对提取率没有显著性差异。
RSD为1.73%,表明测定的精密度良好。
3.2.3. 重复性试验
取同一样品5份,精密称定,用60%的乙醇,按1:20的料液比超声提取2 h,过滤取滤液适当稀释后在360 nm波长处分别测定吸收度,由测得的吸收度计算RSD = 1.89%,说明重复性良好。
3.2.4. 稳定性试验
取3.2.3得到的同一个供试品溶液,室温放置,分别于0 h,1 h,2 h,3 h,4 h,5 h,于360 nm测定吸收度值,计算得到其RSD = 1.39%。说明样品在5 h内稳定性良好。
3.2.5. 加标回收率试验
精密称取已经测定含量的同一个供试品4份,分别加入一定量的芦丁对照品溶液,按供试品制备和测定方法操作。计算其平均加标回收率为91.8%,RSD为3.40%。
3.3. 样品测定
取不同品种的石榴皮样品各约0.5 g,精密称定,用60%的乙醇按1:20的料液比超声提取2 h后定容至100 ml,过滤后精密量取续滤液1 ml用60%乙醇定容到25 ml,在360 nm波长处分别测定吸收度。计算其含量测定结果为(干重):甜绿籽9.40%;甜光颜7.42%;酸绿子10.94%;酸沙子11.83%.
![](//html.hanspub.org/file/3-1710138x13_hanspub.png)
Figure 4. The ultraviolet spectral scanning of rutin
图4. 芦丁对照品的紫外光谱扫描图
4. 讨论
1) 测定波长的选择:用0.01164 mg/ml的芦丁对照品溶液,在200~400 nm波长范围内扫描,可见在210 nm,268 nm和360 nm处有最大吸收(见图4),360 nm波长处峰平坦并且干扰少,所以选择360 nm作为本实验的测定波长,文献 [7] 则用258 nm测定。
2) 本文比较了超声提取和热回流提取,其提取率差别很小,而超声提取简便快速,所以选择用超声提取处理样品。其他提取方法还有水提醇提,微波提取 [8] 等。
3) 本文所测定四个品种的石榴皮中总黄酮含量,酸的品种比甜的品种含量高,与同样样品测定没食子酸的含量一致 [9] ,该方法简便,快速,测定的准确度,精密度和线性关系都令人满意,可以用于石榴皮中总黄酮的测定。
基金项目
云南省教育厅科学研究基金项目资助(2016ZDX225),云南省科技厅–昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目[2017FE468(-186)]。
NOTES
*通讯作者。