1. 引言
地胆草,为菊科地胆草属植物,主治感冒、扁桃体炎、眼结膜炎、黄疸、湿疹等症,有清热、凉血、解毒、利湿之功效。据报道地胆草主要含倍半萜内酯、三萜、黄酮、甾醇等化合物 [1] 。其中倍半萜内酯具有一定的抑制肿瘤及细胞毒作用 [2] 。为了更好的科学合理利用中药地胆草的生物活性,本研究提取分离了地胆草中的羽扇豆醇并采用反相液相色谱法对地胆草中羽扇豆醇的含量测定方法进行了研究。
2. 实验
2.1. 实验原料
羽扇豆醇对照品,购于Ark公司,HPLC检测其纯度 ≥ 98%。
甲醇(色谱纯,Alfa),水为超纯水,氯仿、醋酸乙酯(分析纯,国药化学试剂公司)。地胆草,药材于60℃干燥24 h,粉碎,过24目筛,制成粗粉,备用。
2.2. 表征方法
熔点测定使用X-4双目镜视显微熔点测定仪;红外光谱用Nicolet Impact 410型红外光谱仪测定(美国Thermo Nicolet公司);核磁共振用BrukerDRX-400型核磁共振仪(瑞士Bruker公司,CD3Cl为氘代试剂,TMS为内标);质谱用赛默飞ISQ™ LT,单四极杆,GC-MS系统测定。Wondasil C18型高效液相色谱仪。
3. 方法与结果
3.1. 地胆草中羽扇豆醇的提取及纯化
3.1.1. 羽扇豆醇的提取与分离
地胆草干燥全草10 kg,用体积分数80%工业酒精回流提取,减压浓缩至无醇味,将浓缩液分别用石油醚,乙酸乙酯,饱和正丁醇萃取,并萃取液浓缩,得石油醚部分浸膏65 g,乙酸乙酯部分浸膏500 g及正丁醇部分浸膏240 g。由于羽扇豆醇极性小,其应存在于石油醚浸膏里,因而对石油醚部分浸膏上硅胶柱色谱,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,分离得到A;将A再经反复硅胶柱色谱,分离得到化合物Y1。
3.1.2. 结构鉴定
对所得粉末晶体进行紫外(UV)、红外(IR)、核磁共振谱(NMR)、质谱(MS)检测,根据光谱表征,进行波谱解析确定其组成与结构。结果表明:white microcrystalline powder;mp 213.0℃;[α]25D + 25.7 (c 0.70 in CHCl3);UV(CHCl3) λmax(ε) 228(60.1),285(31.8) nm;IR (KBr) ʋmax 3326,2931,1631,1450,1377,1035,874;EIMS m/z (%) 425(18) [M+-H],409(23) [M+-OH] 218(68),207-(60),and 189(100);1H NMR (CDCl3) δ 0.77,0.80,0.84,0.95,0.97,1.03 and 1.70 (each 3H, s, H-23, 24, 25, 26 27, 28, and 30),2.38 (1H, dt, J = 4.0 and 9.6 Hz, H-19),3.19 (1H, dd, J = 4.8 and 11.6 Hz, H-3),4.57 (1H, brs, H-29b),4.68 (1H, brs, H-29a);13C NMR (CDCl3) δ 39.1,27.8,79.3,39.2,55.6,18.7,34.6,41.2,50.7,37.5,21.3,25.5,38.4,43.2,27.8,35.9,43.4,48.3,48.6,151.1,30.2,40.4,28.4,15.8,16.5,16.3,14.9,18.4,109.6,19.7 (C-1-C-30, respectively)。附图1,图2。
3.2. 反相HPLC法测定地胆草中羽扇豆醇含量
3.2.1. 色谱条件
色谱柱Wondasil C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 µm);流动相甲醇-水(9:1),流速1.0 mL∙min−1;紫外检测波长206 nm;柱温为30℃;进样量20 µL。通过对照空白样品,在该液相色谱条件下,羽扇豆醇对照品和地胆草样品的色谱图见图3。
Figure 2. 13C NMR spectra of lupeol
图2. 羽扇豆醇的13C NMR
Figure 3. Determination of lupin content in lupin HPLC
图3. 羽扇豆醇含量测定HPLC图
3.2.2. 羽扇豆醇对照品溶液的制备
取羽扇豆醇对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并制成250 µg∙mL−1的溶液,摇匀,即得。
3.2.3. 供试品溶液的制备
取地胆草样品粉末2.0000 g,精密称定,置于100 mL具塞三角瓶中,精密加入甲醇100 mL,称定质量,40℃水浴温浸15 h,超声振荡提取40 min,冷却,再称重,用甲醇补足减失的质量,摇匀。经0.22 µm微孔滤膜过滤,取滤液,即得供试品溶液。
3.2.4. 标准曲线的绘制
取羽扇豆醇对照品溶液,经0.22 µm微孔滤膜过滤,取滤液,备用。分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 mL置于100 mL容量瓶中,加甲醇至刻度线,制成浓度为0.25、0.50、1.0、2.5、5.0 µg∙mL−1的羽扇豆醇对照品溶液,分别进样20 µL,以所得色谱峰的峰面积为纵坐标(y),羽扇豆醇的量(µg)为横坐标(x)进行线性回归,回归方程为y = 456.9x + 15.09 (r = 0.9998, n = 6),线性范围0.25~5.0 µg∙mL−1。
3.2.5. 仪器精密度试验
取5.00 µg∙mL−1的对照品溶液,按上述色谱条件连续进样5次,测得结果分别为5.010 µg∙mL−1、4.996 µg∙mL−1、5.001 µg∙mL−1、4.995 µg∙mL−1、5.011 µg∙mL−1,RSD为0.15%。结果表明仪器精密度高。
3.2.6. 稳定性试验
取供试品溶液,分别在2,4,8,12,24,48,72 h内按上述色谱条件测定样品中羽扇豆醇含量分别为0.021%,0.025%,0.023%,0.020%,0.024%,0.022%,0.023%。结果表明,羽扇豆醇含量的RSD为5.94%。因此,样品溶液在72 h内稳定。
3.2.7. 重复性试验
取地胆草样品2.0000 g,共5 份,精密称定,按3.2.6项下操作,分别测定羽扇豆醇的含量。结果表明,五份样品测得羽扇豆醇含量分别为:0.0230%、0.0221%、0.0230%、0.0220%、0.0230%,平均值为0.0226%,RSD为2.31%,结果表明该实验方法重复性良好。
3.2.8. 加样回收率试验
取已测得含量的地胆草样品(0.0226%)约2.0 g,精密称定,分别加入一定量的羽扇豆醇对照品,按供试品的制备及上述色谱条件测定,计算回收率。结果表明平均回收率为98.1%,RSD为1.87%,见表1。
Table 1. The recovery rate of lupeol in the extract of Elephantopus scaber Linn. (n = 6)
表1. 地胆草提取物中羽扇豆醇的加样回收率(n = 6)
3.2.9. 样品测定结果
按上述色谱条件进行反相-HPLC分析,按外标法计算地胆草中羽扇豆醇的百分含量,结果测得为0.0226%。
4. 结论
1) 本研究通过地胆草中羽扇豆醇的提取,并在提取之后对比反相-HPLC法测定地胆草中的羽扇豆醇含量,建立RP-HPLC含量测定方法。通过精密度试验,重复性试验以及加样回收率试验证实该方法简便易行,准确性高,可为地胆草药材的质量控制和评价提供方法。
2) 本研究考察了化学提取法分离提取地胆草中羽扇豆醇的含量,与反相-HPLC法所测含量相比,含量更低,这可能是由于在提取过程中反复的提取分离对产物有损失。
3) 采用反相–液相色谱法,可有效的控制地胆草中羽扇豆醇的质量,且该方法重复性好,操作简便、灵敏、准确。
基金项目
江西省卫生厅科技计划项目(2013A043),校级课题(YB201319)资助。