1. 引言
苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.24)催化苯丙氨酸非氧化性脱氨生成反式肉桂酸,是一个连接初级代谢和次级代谢的酶。1961年,Koukol J和Conn E E首次在大麦中发现PAL,并进行了分离纯化 [1] 。随后,关于PAL的研究迅速展开,目前已经在水稻、大豆等多种高等植物及藻类、真菌、细菌中发现PAL的存在,且已经对美国南瓜 [2] 、枸杞 [3] 、梨 [4] 等多种植物的PAL基因进行了分子克隆及序列分析 [5] 。
研究发现,PAL是一种由4个亚基构成的寡聚酶,不同来源的PAL分子量略有差异,但一般在270~330 KDa之间。不同植物的PAL氨基酸组成不同,如玉米、马铃薯两种植物PAL中的酸性氨基酸含量高于水稻,而中性氨基酸含量则低于水稻 [5] 。不同来源的PAL最适pH不同,通常为8.0~9.5,如菜豆PAL最适pH为8.8~9.2,甘薯PAL最适pH为8.5~9.5,水稻PAL最适pH为9.2 [6] 。不同物种PAL基因家族成员的数量有明显差异,如拟南芥含有4个PAL基因、大豆含有7个PAL基因 [7] 。
PAL对植物生理代谢具有重要意义,参与植物的木质化、色素合成、根瘤形成等生理过程 [8] ;对植物抗逆境也有重要作用,与植物抗病性密切相关。小麦是三大农作物之一,在人类的日常生活中发挥重要作用,对其进行科学研究具有重要意义。本实验中首先挖掘了小麦PAL基因的序列,随后进行了小麦PAL的提取、纯化、活性测定 [9] ,最后进行了SDS-PAGE电泳,希望为小麦PAL的研究提供新的数据支持。
2. 材料与方法
2.1. 数据库及软件
使用在线BLAST服务在植物基因组学资源数据库(Phytozome v12.1.5, https://phytozome.jgi.doe.gov)和裸子植物基因组资源数据库(ConGenIE, http://congenie.org)中搜索不同物种的PAL基因序列。使用MUSCLE多序列比对在线服务网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle)和BioEdit v7.0.5.3软件(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)对搜索得到的PAL序列进行多序列比对,然后使用Model Generator v0.85软件计算多序列比对后PAL序列的最佳氨基酸替代模型,最后使用PhyML v 3.1软件(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml)构建最大似然法(Maximum Likelihood, ML)系统进化树。在PLEXdb网站(http://www.plexdb.org)的数据库中搜索小麦PAL基因的表达模式数据,并使用HemI v1.0.3.7软件(http://hemi.biocuckoo.org)绘制基因表达模式热图。
2.2. 植物材料
普通小麦,浸种12 h,光照时间12 h/day,20℃培养8天。
2.3. 仪器及试剂
2.3.1. 主要仪器
光照培养箱、水浴锅、紫外检测仪、紫外分光光度计、层析柱、电泳仪。
2.3.2. 主要试剂
酶提取液:0.1 mol/L Tris-H2SO4缓冲液(pH 8.3),1 mmol/L EDTA-Na2,5%甘油,7 mmol/Lβ-巯基乙醇;
洗脱液A:50 mmol/L Tris-H2SO4缓冲液(pH 8.3),1 mmol/L EDTA-Na2,5%甘油,2% β-巯基乙醇;
洗脱液B:50 mmol/L Tris-H2SO4缓冲液(pH 8.3),1 mmol/L EDTA-Na2,5%甘油,2% β-巯基乙醇;0.6 mol/L NaCl;
透析液:50 mmol/L Tris-H2SO4缓冲液(pH 8.3),1 mmol/L EDTA-Na2,50%甘油,2%β-巯基乙醇。
2.4. 实验方法
2.4.1. 小麦PAL蛋白的粗提取
称取10 g小麦幼叶,剪碎,加入20 mL酶提取液在冰上低温研磨;过滤,4℃冷冻离心30 min,取上清并量取该粗提取液体积(样品1)。
2.4.2. 小麦PAL蛋白的分级沉淀
按所得体积称量2份(NH4)2SO4,分别使粗提取液达到40%、70%饱和度;将第一份(NH4)2SO4加入粗提液中缓慢搅拌,全部溶解后再持续搅拌10 min,静置20 min,4℃冷冻离心15 min,取上清;再将第二份(NH4)2SO4按同样方式加入,离心后取沉淀;用5 mL酶提取液溶解沉淀(样品2)。
2.4.3. 小麦PAL蛋白的分子筛层析及透析
用0.02 M磷酸盐缓冲液处理Sephadex G-25凝胶柱料,装柱并连接到检测系统,用0.02 M磷酸盐缓冲液和洗脱液A进行平衡并校正系统示数,上样后用洗脱液A洗脱,收集洗脱液。再用200,000 MD的透析袋和甘油浓度50%的透析液进行透析,至终体积约5 mL (样品4)。
2.4.4. 小麦PAL蛋白的阴离子交换层析及透析
参照《高级生物化学实验》( [10] , p.84)的处理方法对DEAE-葡聚糖柱料进行预处理,装柱后连接到检测系统,用洗脱液A进行平衡及校正系统读数,上样,用洗脱液A洗杂,当检测仪示数稳定后加入洗脱液B进行洗脱,收集洗脱液。最后用相同的透析袋和透析液进行透析,至终体积约5 mL。
2.4.5. PAL蛋白的浓度及活性测定
使用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,用表1方法进行PAL蛋白的活性测定。
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Table 1. Sample protein activity determination method
表1. 样品活性测定方法
2.4.6. PAL蛋白的SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE凝胶制备配方如下:
浓缩胶:30%Acrylamide 0.63 mL,1.5%AP0.25 mL,浓缩胶缓冲液1.25 mL,ddH2O 2.87 mL,TEMED 20 ul;
分离胶:30% Acrylamide 4.0 mL,1.5%AP 0.5 mL,浓缩胶缓冲液1.25 mL,ddH2O 4.25 mL,TEMED 40 ul。
3. 结果与分析
3.1. PAL基因家族的基因搜索及系统进化分析
我们以已经发表的4条拟南芥(Arabidopsis thaliana) PAL基因序列为模板,在Phytozome数据库中搜索得到6个物种的71条PAL基因序列,其中小麦(Triticum aestivum) 26条、玉米(Zea mays) 10条、水稻(Oryza sativa) 9条、毛果杨(Populus trichocarpa) 5条、江南卷柏(Selaginella moellendorffii) 9条、小立碗藓(Physcomitrella patens) 12条;同时在ConGenIE数据库中搜索得到2个裸子植物的16条PAL基因序列,包括挪威云杉(Picea abies) 5条、火炬松(Pinus taeda) 11条。使用MUSCLE软件对这91条PAL基因序列进行多序列比对,使用BioEdit软件对比对后的序列进行手动调整和校正,然后使用Model Generator软件计算出最适氨基酸替换模型为JTT + G + F。最后使用PhyML软件对这91个基因构建最大似然法系统进化树(图1)。进化树显示小麦PAL基因发生了明显的基因扩张,预示着PAL基因可能对小麦的生长和发育等具有重要的作用和意义。
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Figure 1. Phylogenetic tree of 91 PAL genes
图1. PAL基因系统进化树
3.2. 小麦PAL基因家族的表达模式分析
基于PLEXdb网站的数据,我们搜索得到小麦PAL基因的基因表达数据,使用HemI软件绘制基因表达模式热图(图2)。结果显示,70%以上的小麦PAL基因在幼嫩组织中的表达量均高于成熟组织。其中,TaPAL1、5、7、11、12这5个基因在各组织部位中的表达量较低,而TaPAL21、25这两个基因在各个组织中均有较高的表达量。
3.3. 小麦PAL基因的提取及活性测定
将小麦幼苗按2.4所述方法进行PAL蛋白的粗提取,取1mL留样(样品1)进行蛋白浓度及活性测定;盐析后得到5 mL的粗提液,留样(样品2),再用Sephadex G-25凝胶为柱料的分子筛进行脱盐处理,所得层析图谱如图3所示。查阅文献可知,小麦PAL的分子量约为280 kDa [9] ,进行分子筛时会因分子量较大而先被洗脱,因此判断层析图谱的第一个峰为目标蛋白的洗脱峰(预实验中对2个洗脱峰进行测活,峰1具有PAL蛋白酶活性)。
将洗脱液透析浓缩后得到6 mL的蛋白粗提液,取1 mL留样(样品3)。剩余粗提液用DEAE-葡聚糖凝胶进行阴离子交换层析,得到图4所示层析图谱。从图上可以看出,46 min开始出现洗脱峰,且分为2个小峰,将这前后两个峰分别进行收集,透析浓缩后分别留样(样品4、5)。
3.4. 小麦PAL基因的SDS-PAGE电泳
本次SDS-PAGE电泳结果如图5所示,查阅文献资料得知,小麦PAL是由4个相同亚基构成的蛋白,单一亚基的分子量大小约70 kDa [5] 。商品PAL来自于粘红酵母,单一亚基的分子量大小约78 kDa。图中的样品1~3不能清晰的看到PAL蛋白条带,但是经过高度浓缩的样品4中出现了清晰的PAL蛋白条
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Figure 2. Heat map of wheat PAL genes expression pattern
图2. 小麦PAL基因的表达模式热图
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Figure 3. Molecular mapping of wheat PAL protein extraction
图3. 小麦PAL蛋白提取的分子筛图谱
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Figure 4. Anion exchange chromatography of wheat PAL protein extraction
图4. 小麦PAL蛋白提取的阴离子交换层析图谱
注:1. 分子量97.4 kDa;2. 分子量66.2 kDa;3. 分子量43.0 kDa;4. 分子量31.0 kDa;5. 分子量22.0 kDa;6. 分子量14.4 kDa;A. 商品PAL蛋白的位置,大小约78 kDa;B. 样品4中PAL蛋白的位置,大小约70 kDa
Figure 5. Wheat PAL protein SDS-PAGE electrophoresis results
图5. 小麦PAL蛋白SDS-PAGE电泳结果
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Table 2. Wheat PAL protein extraction results
表2. 小麦PAL蛋白提取结果
注:① 提纯倍数 = 每次纯化后比活力(U/mg)/第一次比活力(U/mg);② 回收率 = 提纯后总活力(U)/提纯前总活力(U)。
带,其大小与文献所述相吻合,而同样经过高度浓缩的样品5中却不能清楚看到PAL蛋白条带。
3.5. 小麦PAL蛋白的活性分析
参照《高级生物化学实验》( [10] , p.37)所列方法制作蛋白标准曲线,再按2.4.5方法分别测定样品1~5的蛋白浓度及活性,计算并填写表2。
从表2中可以看出,样品1~4的比活力、提纯倍数都呈现逐渐递增的趋势,总蛋白、回收率则出现了递减的趋势,说明PAL蛋白经过粗提、盐析、分子筛、阴离子交换之后确实得到了纯化,且随着纯化步骤的进行,不断有杂蛋白被分离出去,最后获得了纯度较高的小麦PAL蛋白。而样品5虽然有PAL蛋白的活性,但是比活力和纯化倍数都较低,推测该样品中有较大比例的杂蛋白存在,而PAL蛋白含量较少。
本研究以9种陆地植物的91个PAL基因为对象进行系统进化分析,发现小麦PAL基因的数量远多于其他物种,预示着该基因家族在小麦中可能经历了基因扩张事件;随后对小麦PAL基因进行表达模式的分析,发现幼嫩组织中具有较高的表达量;最后进行了小麦嫩叶组织中的PAL蛋白提取实验,结合亲和层析、SDS-PAGE电泳及PAL活性测定等实验的结果可知,此次实验提取到的样品4为纯度较高的小麦PAL蛋白。
4. 讨论
本研究利用Phytozome、ConGenIE和PLEXdb数据库,MUSCLE、BioEdit、ModelGenerator、PhyML和HemI等软件完成了小麦PAL基因家族的挖掘、进化树的构建、表达模式数据的收集及热图的绘制,对苔藓植物、石松类植物、裸子植物和被子植物9个代表物种的PAL基因的系统发生关系进行了初步的计算。实验提取部分包含粗提、盐析、分子筛、阴离子交换、SDS-PAGE电泳等几个主要步骤,通过PAL蛋白的活性测定、SDS电泳的实验结果证明了小麦PAL蛋白的成功提取。在预实验中,直接使用样品4、5进行SDS电泳,并未得到正确的目的条带,随后对样品4、5分别进行高度浓缩,至终体积约100 ul,并再次电泳,最后得到了图5所示电泳图。从SDS-PAGE电泳图中可以看到,样品1~5中都含有一种分子量大小在46 kDa左右的蛋白,经过几种纯化方式都没有被除去,可能是一种性质与PAL蛋白相似的组成型蛋白,在后期的研究中,可以针对这种蛋白再展开研究,进一步确定其具体情况。
其他学者的研究结果表明,PAL是一种诱导型蛋白,低温、机械损伤、病原菌感染、毒素处理等多种因素都能诱导PAL表达,赤霉素等植物激素的刺激亦能导致PAL活性的上升,进而影响植物的生理和生化功能。在后续的研究中,可以采用激素诱导表达的方式探究不同植物激素浓度对PAL表达量及活性的影响,从而为优化植物生长提供理论支持。
基金项目
国家自然科学基金“杨树赤霉素代谢途径的解析及相关基因家族的功能分化机制研究”。