1. 引言
“吃在广东”,而广东又以老火靓汤最为出名,作为食材的虫草花目前的研究报道较少。虫草花又称北虫草、蛹虫草(Cordyceps militaris),是人工培养的虫草子实体,属于一种真菌类(Fungi),是运用现代生物工程技术开发出来的,可供人们食用和药用的菌类新品种。虫草花内含有虫草素、虫草酸、多酚、多糖、腺苷等多种活性物质,具有抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等功效,民间常用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。当前,就虫草花活性成分提取工艺、抗氧化性、降糖活性的研究很少。我们以总多酚含量(没食子酸)为观察指标,探讨了虫草花活性成分浸提的最优工艺,为进一步开发虫草花资源提供理论依据。
2. 实验与方法
2.1. 试材
虫草花干500 g (广州市兴华干货,原产地广东江门新会)
2.2. 试材的处理方法
2.2.1. 试材前处理流程
将虫草花于干燥箱内60℃烘干,粉碎机粉碎,过200目筛。准确称量100 g粉末,按单因素和正交实验条件用80%乙醇溶液浸提,转速3000 rad/min离心处理,收集离心所得滤液为提取液。
2.2.2. 虫草花活性成分的粗提取方法
参考景临林等人,取上述1.2.1最后所得的多酚提取液于1000 mL的圆底烧瓶中,用旋转蒸发仪将其旋干,得到虫草花80%醇提部分 [1] 。提取物加5倍量的蒸馏水超声10 min得到悬浮液,将其移置250 mL分液漏斗中,依次用10 mL的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次,合并各自萃取液并保留水相,用旋转蒸发仪分别将其旋干,得不同溶剂萃取物 [2] 。
2.3. 虫草花活性成分提取
2.3.1. 单因素试验设计
选取料液比、乙醇含量、提取温度和浸泡时间4个可能影响提取效果的因素,以总多酚含量为考察指标进行单因素试验,以确定相关因素及各因素的适宜范围,见表1。
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Table 1. The factor level of single experiment
表1. 单因素试验因素水平表
2.3.2. 正交试验设计
根据单因素试验确定的范围,选定料液比、提取温度、乙醇含 、浸泡时间4个主要影响因素进行正交试验以考察最佳提取工艺条件,见表2。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. The factor level of orthogonal experiment
表2. 正交试验因素水平表
2.3.3. 虫草花活性成分含量计算
1) 没食子酸标准曲线的制作
参考欧阳玉祝等人文献,准确称取2.4 mg没食子酸标准品于25 mL容量瓶中,用移液枪移取24 mL蒸馏水至容量瓶中,震荡摇匀,配成0.1 mg/mL的标准液,分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL没食子酸标准液于6支试管中,再分别滴加5.0、4.0、3.0、2.0、1.0和0.0 mL蒸馏水,2 mL酒石酸亚铁溶液,2 mL pH = 7.5的缓冲溶液,混匀静置20 min,以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照,用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测各种标准溶液的吸光度 [3] 。
2) 虫草花多活性组分总多酚含量计算
按照标准曲线计算出虫草花中总多酚质量浓度(C, mg∙mL−1),按以下公式计算样品中总多酚含量W(mg∙g−1):
总多酚含量W = CV/m,
式中:W为虫草花中总多酚含量(mg∙g−1);C为虫草花多酚质量浓度(mg∙mL−1);V为体积(mL);m为虫草花粉末质量(g)。
3) 测定方法:① 取不同组分的浸膏0.045 g,用7 mL 80%乙醇将其溶解于试管中。配制成相同浓度的虫草花萃取物。从试管中取2 mL上述萃取物与另一支试管中。加入2 mL酒石酸亚铁溶液,2 mL pH = 7.5的缓冲溶液,混匀静置20 min,以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照,用紫外可见分光光度计于波长 540 nm 处测各种标准溶液的吸光度。
② 取1.2.1流程最后得到的提取液2 mL,加入2 mL酒石酸亚铁溶液,2 mL pH = 7.5的缓冲溶液,混匀静置20 min,以不含没食子酸标准液的溶液代替标准溶液作空白对照,用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测各组标准溶液的吸光度。
2.3.4. 虫草花不同溶剂提取部分活性成分比较
取1.2.2所得的不同溶剂萃取物,对各个成分之间采用DPPH、ABTS、α-葡萄糖苷酶三种体外抗氧化测定方法进行活性测试 [4] [5] [6] [7] 。
3. 实验结果与讨论
3.1. 虫草花活性成分提取物
按1.2.2所述方法,依次80%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同溶剂萃取物,结果如表3所示,平行测定三次结果。
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Table 3. The active ingredient extract of Cordyceps flower
表3. 虫草花活性成分提取物列表
3.2. 虫草花没食子酸标准曲线结果
以吸光度(A)为横坐标,以没食子酸含量(mg∙mL−1)为纵坐标绘图,结果进行线性回归得回归方程:Y = 22.136x − 0.1277(R2 = 0.9982)。标准曲线图1表明,没食子酸在质量浓度为0.01~0.06 mg∙mL−1区间有良好的线性关系。
式中:Y为吸光度;x为没食子酸标准质量浓度(mg∙mL−1)。
Figure 1. The standard curve of the Gallic acid
图1. 没食子酸标准曲线
3.3. 提取条件对虫草花多酚提取效果的影响
3.3.1. 料液比对总多酚提取效果的影响
浸泡时间2 h,乙醇含量60%,提取温度80℃,由图2可知,总多酚提取率随料液比的增大而先增大后降低,最佳提取的料液比为1:20,1:15,1:25的提取率也较高。这可能是因为料液比为1:20时,溶剂对多酚的溶解已基本达到饱和,继续增加溶剂用量,并不能显著提高多酚的提取量。而料液比越大,在浓缩过程中消耗的时间越长,多酚被氧化的可能性提高,同时也加大了浓缩时的能量消耗,不利于总多酚的提取,因此将正交试验中的料液比分别定为1:15、1:20和1:25。
![](//html.hanspub.org/file/6-1560123x11_hanspub.png)
Figure 2. The effect factor of martial liquid ratio on extraction
图2. 料液比对总多酚提取效果的影响
3.3.2. 乙醇含量对总多酚提取效果的影响
浸泡时间2 h,料液比为1:20,提取温度80℃的提取。由图3可知,总多酚提取率随乙醇含量的增大而先增大后降低,最佳提取的乙醇含量为70%,60%,80%的提取率也较高。这可能是因为乙醇含量为80%时,乙醇含量过高,会将其他杂质也提取出来,不利于总多酚的提取,因此将正交试验中的乙醇含量分别定为60%、70%和80%。
![](//html.hanspub.org/file/6-1560123x12_hanspub.png)
Figure 3. The effect of ethanol content on extraction
图3. 乙醇含量对总多酚提取效果的影响
3.3.3. 提取温度对总多酚提取效果的影响
浸泡时间2 h,乙醇含量60%,料液比1:20的提取结果。由图4可知,总多酚提取率随温度的升高而先增大后降低,当温度超过70℃后,总多酚质量浓度下降。最佳提取的提取温度为70℃。50℃,60℃的提取率也较高。从中可推测影响提取率原因是:当提取温度超过60%乙醇的沸点时,溶液剧烈沸腾产生的气泡使原料粉末黏附于容器壁上,导致原料未能充分被溶剂浸提;另外也可能是由于提取温度过高造成多酚分子的结构破坏。因此将正交试验中的提取温度分别定为60℃、70℃和80℃。
![](//html.hanspub.org/file/6-1560123x13_hanspub.png)
Figure 4. The effect of soaking temperature on extraction
图4. 提取温度对总多酚提取效果的影响
3.3.4. 浸泡时间对总多酚提取效果的影响
料液比1:20,乙醇含量60%,提取温度80℃的提取结果。由图5可知,总多酚提取率随浸泡时间的增加而先增大后降低,当浸泡时间为1.5小时时总多酚质量浓度最大,之后随浸泡时间的继续增加,总多酚质量浓度呈下降趋势,因此最佳提取的时间为1.5 h。2 h的提取率也较高。这可能是因为浸泡时间越长,多酚被氧化的可能性提高,乙醇含量也对多酚的分子结构,不利于总多酚的提取,因此将正交试验中的浸泡时间分别定为1 h、1.5 h和2 h。
![](//html.hanspub.org/file/6-1560123x14_hanspub.png)
Figure 5. The effect of soaking time on extraction
图5. 浸泡时间对总多酚提取效果的影响
3.4. 正交试验结果
正交试验结果见表4,从表4分析可知:各因素对虫草花总多酚产率的影响程度不同,其影响的主次顺序为:B(乙醇含量) > C(提取温度) > A(料液比) > D(浸泡时间)。由试验数据可以得出:乙醇含量为显著影响因素,极差分析最优组合是A3B3C3D1,最佳提取工艺条件为:料液比1:25 (g/mL),乙醇含量为80%,提取温度80℃,浸泡时间为1 h。
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Table 4. The result of orthogonal experiment
表4. 正交实验结果
3.5. 虫草花多活性组分总多酚含量计算结果
样品中的多酚含量由没食子酸标准曲线:Y = 22.131x − 0.1283(R2 = 0.99735)换算得来,① 各提取物部位多酚含量如表5所示:80%醇提物中多酚类化合物含量最高4.7817 mg∙g−1,然后依次是水萃取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物,分别是3.8891 mg∙g−1、3.8680 mg∙g−1和3.4744 mg∙g−1。正丁醇萃取物多酚含量最低,仅为2.8769 mg∙g−1。各活性组分总多酚含量的大小排序为:80%醇提物 > 水萃取物 > 石油醚萃取物 > 乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物。
② 测得虫草花提取液中总多酚的平均质量浓度是0.8382 mg∙g−1。
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Table 5. The content of Gallic acid in the different solvent extracts
表5. 虫草花乙醇提取物不同溶剂萃取物中总酚含量测定(mg∙g−1)
3.6. 虫草花不同溶剂提取物活性测试计算结果
由表6可知,对DPPH自由基的清除作用,不同极性部位清除DPPH自由基的能力顺序为:乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物 > 石油醚萃取物 > 水萃取物 > 80%醇提物。对ABTS自由基的清除作用不同极性部位清除ABTS+·自由基的能力顺序为:乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物 > 80%醇提物 > 石油醚萃取物 > 水萃取物。对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用乙酸乙酯部分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强,然后依次是80%醇提物部分 > 石油醚部分 > 剩余水相部分 > 正丁醇部分。
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Table 6. The active ingredients of Cordyceps flower in the different solvent extracts
表6. 虫草花不同溶剂萃取物活性成分
4. 结论与讨论
由虫草花多酚提取条件的研究可知,各因素对虫草花多酚提取得率的影响次序是:乙醇含量 > 提取温度 > 料液比 > 浸泡时间。从成本角度考虑,最佳提取工艺为:乙醇含量80%,提取温度80℃,浸泡时间60 min,料液比1:25 (g/mL),在以上最优条件下虫草花多酚提取物中多酚含量为51.23%。
多酚类化合物大多具有酚羟基,易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂,乙醇溶解性能较好,对植物细胞的穿透能力较强,与甲醇相比,具有毒性小、来源方便等特点,故试验选择乙醇作为提取溶剂。单因素及正交试验结果表明,不同提取因素对虫草花多酚提取效果的影响很大,各因素对其多酚提取效果的影响由大到小依次为乙醇含量、提取温度、料液比、浸泡时间。优化的最佳提取工艺为乙醇体积分数80%,料液比1:25 (g/mL),浸泡时间为60 min,提取温度80℃。在此条件下进行重复性试验,测得多酚提取物中多酚含量为51.23%。该方法操作简单准确度高,环境污染小,可作为虫草花中多酚的提取和含量测定。
该研究采用体外模型从ABTS+•自由基和DPPH自由基(DPPH•)的清除能力及α-葡萄糖苷酶活性抑制率等角度评价其活性。虫草花中多酚类化合物对DPPH•和ABTS+•的清除率分别可达88.73%和84.71%,α-葡萄糖苷酶活性的IC50为60 μg/mL,说明虫草花中含有多酚类化合物,具有较好的抗氧化功能,是一种具有较大开发价值的药食同源食用菌 [6] [7] 。
基金项目
中山市科技局项目(2015syf0202)。