1. 引言
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)系茄科(Solanceae)枸杞属(Lycium L.)植物 [1] ,是西北干旱地区一种特有的多年生灌木野生植物,耐干旱,生长于盐碱土荒地或沙地,可作为水土保持的灌木植物 [2] 。果实味甘、性平、清心热,藏医上将其用于治疗心脏病、月经不调、心热病、停经等病症;民间用作明目、滋补强壮及降压药 [3] [4] 。现代药理学研究表明黑果枸杞中丰富的脂肪酸、蛋白质、游离氨基酸、矿质元素等,有利于人体直接吸收 [5] ;黄酮类化合物具有抗氧化活性 [6] ;多糖具有抗疲劳、降血糖 [7] [8] 等药理活性;花色苷具有抗氧化、抗突变、清除自由基、抗动脉硬化、减轻眼的疲劳、抑制流感病毒和疱疹病毒等活性 [9] [10] 活性,而抗氧化、清除自由基与原花青素同样也是密不可分的。
原花青素是生物类黄酮的一族,多酚类的一种,是植物的二次代谢产物,被国际上公认为清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂,并且还具有抑制肿瘤、抗乙肝病毒等功能 [11] 。因此在医药、保健品等行业有极大的需求,其提取工艺必然成为研究的重要部分。层析法、微波法、超声法、超临界CO2法等方法已经应用到原花青素的萃取工艺中 [12] [13] [14] [15] 。其中层析法选择性好,但树脂本身化学结构和洗脱溶剂对目标产物分离有一定影响;微波法提取效率高,但对分子结构产生破坏;超声波法萃取时间短,但不可避免会使用到有机溶剂;超临界CO2法工艺简单,但是为提高对极性较强物质的萃取率需引入极性夹带剂,这就破坏了该工艺的绿色环保特性,且工艺复杂。亚临界流体萃取法作为一种新型的萃取方法,其R134a对极性物质的溶解能力强、扩散系数大、黏度系数小 [16] ,在液态和临界点附近具有良好的溶剂性能,尤其适合天然原料的萃取。在医药、保健品领域具有良好的应用前景 [17] ,有亚临界流体萃取技术应用于生产花青素片的文献报道 [18] 。
本研究采用亚临界流体R134a萃取出黑果枸杞中的原花青素,先考察了单个因素对萃取率的影响,然后通过正交试验考察了各因素的主次关系和它们之间的综合效应,从而优化了萃取工艺。同时在该优化条件下采用香草醛–盐酸法测定了不同产地黑果枸杞中原花青素的含量,为黑果枸杞质量控制提供了一定参考,为其资源的研究与开发利用提供了科学的理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
收集不同来源的8批(每批次均采集3份)共24份黑果枸杞(见表1)。经中国科学院西北高原生物研究所高庆波副研究员鉴定为正品黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)的成熟果实。样品预处理:收集的黑果枸杞避光阴干,粉碎,装入密封袋中密封,置干燥器中避光保存。
R134a (质量分数99%,美国Dupont);原花青素对照品(20315-25-7,HPLC ≥ 95%,上海源叶生物科技有限公司);香草醛(天津市凯信化学工业有限公司),乙醇、甲醇、浓盐酸(山东禹王实业有限公司化工分公司),化学试剂均为分析纯。
2.2. 仪器与设备
亚临界流体萃取装置(广州市浩立生物科技有限公司,由华南理工大学联合研制);Varian Cary 300 Bio紫外–可见分光光度仪(美国Varian公司);AG135精密电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);优普UPE-II-40L超纯水机(上海优普实业有限公司)。
亚临界流体萃取装置如图1所示 [19] ,由溶剂系统、萃取系统、分离系统和溶剂回收系统组成。
表1. 采集的8个不同产地的黑果枸杞(n = 3)
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Figure 1. Schematic diagram of the apparatus for sub-critical extraction
图1. 亚临界流体萃取装置图
2.3. 原花青素的萃取方法
黑果枸杞避光阴干,粉碎后过40目筛,装入密封袋中密封,置干燥器中避光保存以备使用。向筒体微孔陶瓷滤芯6中装入萃取原料黑果枸杞250 g,原料不宜填装过满,并将其装入萃取罐5中,盖好压环及上堵头。
打开冷水机2使制冷水在管道Ⅱ中循环流动,开启热水机及水循环7泵加温。开始制冷的同时,溶剂进入低温溶媒储罐3,液化后液态溶剂经过高压柱塞泵4进入萃取罐5中,等压力平衡好后,打开相应的萃取罐放空阀门,慢慢放掉残留空气,当有气态溶剂顶出时关闭各阀门;启动高压柱塞泵4,通过调节频率来控制溶剂流量的大小,当压力加到接近所需工作压力(约1 MPa左右),开始打开萃取罐5后面的阀门,通过阀门调节萃取罐压力,溶剂进入分离罐8。
萃取结束后,在热水机及水循环7加热情况下,萃取液蒸发溶剂,排出原花青素萃取液。开启真空泵11,打开萃取罐5下面的管路切换阀9,在热水机及水循环7加热情况下,物料脱溶剂和上述萃取液蒸发溶剂汇合后,由气动增压泵12加压后输送至溶剂过滤净化装置13脱除CO2和H2O,净化的溶剂再次进入低温溶媒储罐3中制冷、循环使用。原花青素浓缩萃取液,并再次经甲醇定容后采用香草醛–盐酸比色法对黑果枸杞的原花青素含量进行测定 [20] 。
2.4. 原花青素萃取率的测定方法
2.4.1. 原花青素的测定原理
试验采用香草醛–盐酸法,其反应机理为:原花青素是从植物中分离得到的一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚类化合物,在酸性H+条件下,结构中A环的化学活性较高,其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合,产物在浓盐酸催化下形成了有色的正碳离子。利用原花青素显色后在500 nm处有最大吸收峰比色测定其吸光度值 [20] 。
2.4.2. 标准曲线的建立
精密量取0.5 mg/mL原花青素对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。取各对照品溶液1.0 mL,至25 mL具塞试管中(避光),加入6.0 mL 4 g/100 mL香草醛甲醇溶液混匀,再加入3.0 mL浓盐酸,混匀。室温下显色15 min,同时进行空白试验,于500 nm处测定其吸光度,以质量浓度(ρ)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线,拟合得到线性关系为:
2.4.3. 原花青素的萃取率计算
根据计算得到的原花青素质量浓度可按下式(1)算出原花青素的萃取率y:
(1)
式(1)中:V为溶剂定容总体积,mL;m为萃取原料质量,g。
2.4.4. 数据统计分析
在相同萃取条件下,每个样品重复测定3次,结果以
表示,同时采用SPSS 19.0和Excel处理数据。
3. 结果与讨论
3.1. 正交试验与方差结果分析
在实际操作中,各单因素相互之间并非无关联,而是相互交叉影响的。通过各单因素对原花青素萃取率的影响,由预实验结果确定在萃取剂流量为0.15 L/min条件下,以萃取压力、萃取温度和萃取时间作为考察对象,在单因素试验的基础上设计了三因素三水平正交试验,以确定亚临界流体R134a萃取黑果枸杞中原花青素的适宜工艺条件。同时进行了方差分析,结果分别见(表2)和(表3)。
由表2可知,影响黑果枸杞中原花青素萃取率的各因素主次顺序为:萃取温度 > 萃取压力 > 萃取时间。该正交设计无重复试验,采用SPSS 19.0软件分析可知ss(萃取时间) = 0.015最小,它对整个试验结果影响最小,因而将它作为误差估计,用以检验其他因素作用的显著性。
由表3可知,将萃取时间作为误差时,萃取压力与萃取温度均与萃取时间无显著性差异(P > 0.05),表明这三个因素对黑果枸杞中原花青素的提取率均无显著性影响。综合各种因素,选定最佳提取工艺为:萃取压力1.2 MPa,萃取温度50℃,萃取时间90 min。
3.2. 各因素对原花青素萃取率的影响
3.2.1. 萃取压力
固定试验萃取温度为50℃,萃取时间为90 min的条件下,考察了萃取压力为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 MPa时对原花青素萃取率的影响,试验结果见图2。
由图2可知,黑果枸杞原花青素萃取率随着萃取压力的升高先增加后降低,在萃取压力为1.2 MPa时萃取率达到最大值。随着萃取压力的逐渐升高,亚临界流体R134a的密度也随之增加,溶解力提高,从而使得萃取率增加。但随着萃取压力继续增加,R134a的黏度也随之变大,限制了原花青素的扩散速率,同时黑果枸杞中其他杂质的溶解度增加,影响了R134a对原花青素的选择性,导致原花青素萃取率下降。最终确定黑果枸杞原花青素的最佳萃取压力为1.2 MPa。
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Figure 2. Effect of different extraction pressure on extraction ratio of procyanidins
图2. 不同萃取压力对原花青素萃取率的影响
表2. 以黑果枸杞为原料的L9(34)正交试验结果
表3. 方差分析结果
3.2.2. 萃取温度
固定试验萃取压力为1.2 MPa,萃取时间为90 min的条件下,考察了萃取温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃时对原花青素萃取率的影响,试验结果见图3。
由图3可知,黑果枸杞原花青素萃取率随着萃取温度的升高先增加后降低,在萃取温度为50℃时萃取率最高。随着萃取温度的升高,溶质的蒸汽压也随之增加,有利于其挥发性和传质速率的提高,溶解度增加,从而使得萃取率增加。但随着萃取温度继续升高,亚临界流体R134a的密度也随之降低,溶解力降低,萃取能力下降。此外,原花青素为热敏性成分,温度过高会使其遭到破坏,温度超过50℃时原花青素开始分解,导致原花青素萃取率随着温度的逐渐升高而下降。最终确定黑果枸杞原花青素的最佳萃取温度为50℃。
3.2.3. 萃取时间
固定试验萃取压力为1.2 MPa,萃取温度为50℃的条件下,考察了萃取时间为10、30、60、90、120 min时对原花青素萃取率的影响,试验结果见图4。
由图4可知,黑果枸杞原花青素萃取率随着萃取时间的延长逐渐增加,至萃取时间为90 min时萃取率最高,此后继续增加萃取时间萃取率增加不明显。随着萃取时间的进一步增加,黑果枸杞中的目标产物原花青素逐渐减少,传质阻力逐渐下降,萃取率增长缓慢不明显。因此最终确定黑果枸杞原花青素的最佳萃取时间为90 min。
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Figure 3. Effect of different extraction temperature on extraction ratio of procyanidins
图3. 不同萃取温度对原花青素萃取率的影响
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Figure 4. Effect of different extraction time on extraction ratio of procyanidins
图4. 不同萃取时间对原花青素萃取率的影响
3.3. 不同产地黑果枸杞中原花青素含量测定
黑果枸杞避光阴干,粉碎后过40目筛,向筒体微孔陶瓷滤芯6中装入萃取原料黑果枸杞约200 g,原料不宜填装过满,并将其装入萃取罐5中,盖好压环及上堵头。用亚临界流体萃取装置提取后,目标萃取物经浓缩,并再次经甲醇定容后,采用香草醛–盐酸比色法对黑果枸杞的原花青素含量进行测定。取样品滤液1.0 mL,至25 mL具塞试管中(避光),加入6.0 mL 4 g/100 mL香草醛甲醇溶液混匀,再加入3.0 mL浓盐酸,混匀。室温下显色15 min,同时进行空白试验,于500 nm处测定其吸光度,用标准曲线法计算含量,结果见(表4)。
由表4含量测定结果可知,不同产地样品中原花青素含量依次为青海(平均含量1.82%) > 甘肃(平均含量1.52%) > 新疆(平均含量1.05%)。其中,青海都兰县宗加镇黑果枸杞中原花青素含量最高,新疆精河县黑果枸杞中原花青素含量最低。
有通过有机溶剂用恒温水浴浸提法提取出黑果枸杞中的原花青素的文献报道 [21] [22] ,其不同产地黑果枸杞中的原花青素含量在1.5%~9.0%不等。其中,青海柴达木黑果枸杞中原花青素含量为2.17%,来自新疆精河县的为1.47%,甘肃民勤县的为1.21%,本文通过亚临界R134a流体萃取法得到的这三个产地的黑果枸杞中原花青素含量分别为2.17%、1.47%、1.21%,测定值相当,无显著性差异(P > 0.05),也说明了亚临界流体R134a对于原花青素这一类极性较强物质具有良好的选择性和萃取率。
4. 结论
本文对亚临界流体1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)萃取黑果枸杞中原花青素的最佳工艺进行了研究。以原花青素的萃取率为指标,通过单因素试验和三因素三水平L9(34)正交试验的考察,确定了在萃取压力1.2 MPa,萃取温度50℃,萃取时间90 min为最佳提取工艺条件下,黑果枸杞原花青素的萃取率最高,影响黑果枸杞中原花青素提取率的各因素主次顺序为:萃取温度 >萃取压力 > 萃取时间,并且这三个因素对黑果枸杞中原花青素的提取率均无显著性影响。在该优化条件下采用香草醛–盐酸比色法测定了不同产地黑果枸杞中原花青素的含量。不同产地样品中原花青素含量依次为青海(平均含量1.82%) > 甘肃(平均含量1.52%) > 新疆(平均含量1.05%)。其中,青海都兰县宗加镇黑果枸杞中原花青素含量最高,新疆精河县黑果枸杞中原花青素含量最低。测定结果与相关文献中的报道值相当,无显著性差异(P > 0.05),说明了亚临界流体R134a对于原花青素这一类极性较强物质具有良好的选择性和萃取率。亚临界流体萃取工艺溶剂残留少,不会对物料中的热敏性成分造成损害,脱溶过程不必对物料加热,不仅克服了传统工艺
表4. 不同产地黑果枸杞中原花青素的含量(
, n = 3)
的不足,在保留了超临界流体萃取优点的同时,溶剂选择面大,而且涉及物料广泛,无任何污染,运行成本低,这是其他低温萃取技术无法做到的。尤其适用于植物色素提取、药材成分提取等。已成功应用在天然产物提取、食品工业、中药(包括复方中药)行业等。
基金项目
中国科学院个性化药物先导科技专项资助(XDA12050304),青海省自然科学基金(2015-ZJ-908),青海无公害农产品分析检测平台建设(2015-ZL-Y23),兰州区域中心2016年度仪器功能开发项目:多通道可回收型中试亚临界流体萃取装置的改造(2018 gl11)。
NOTES
*通讯作者。