1. 引言
国兰作为我国十大传统名花之一,主要由春兰、莲瓣兰、蕙兰、建兰、寒兰、墨兰、春剑七大类组成,其观赏价值和经济价值尤为突出,深受人们喜爱。随着人们对兰花需求量日益增大,传统的繁殖方式已不能满足市场需求,桂北地区作为国兰的主产区之一,继续探索出一条新型的国兰繁殖道路,不仅有利于满足市场的需求。更对保护桂北地区国兰的优良种源具有重要意义。与传统的国兰繁殖方式相比,利用组培快繁技术进行国兰的无性繁殖,其繁殖系数更高,繁殖速度更快,受自然条件约束少,可全年生产,可以在短期内获得大量实生苗 [1] 。我国早在上世纪80年代便已开展兰花组培快繁的研究工作,王熊等以建兰(大一白品种)和秋兰为材料,切取茎尖或侧芽的分生组织,诱导形成原球茎,然后形成丛生型原球茎并实现离体增殖生长,成功获得建兰和秋兰的无性系 [2] ;2013年刘幸佳利用对比试验的方法,分别总结出了国兰中寒兰、蕙兰、春兰根状茎分化的适培养基配方 [3] 。本文旨在探究外源激素对桂北地区原生国兰组培快繁的效应,为今后在桂北地区利用组培快繁技术培养原生国兰打下基础。
2. 试验材料与试验方法
2.1. 试验材料
以广西北部广泛生长的蕙兰侧芽作为组培快繁材料,材料采自广西桂林市林业科学研究所。
2.2. 试验方法
2.2.1. 外植体的组织培养
以无病虫害、长势良好的原生蕙兰作为母本,利用解剖刀自母本基部切取幼嫩的侧芽,长度约为5 cm左右,利用手术剪去侧芽顶端已展开的嫩叶,将嫩芽置于清水中,并加入1~2滴洗洁精清洗5 min,然后流水冲洗3~5次;在无菌条件下利用75%酒精和0.1% HgCl2分别进行浸泡灭菌,具体方法为:首先用75%酒精浸泡嫩芽30 s,快速转入无菌水中震荡清洗2~3次;而后用0.1% HgCl2浸泡5 min,边浸泡边震荡,浸泡结束后转入无菌水中冲洗4次~5次;最后利用无菌滤纸吸干多余水分,并将茎尖切下,接种于诱导培养基中。
2.2.2. 诱导生成原球茎
诱导原球茎试验以MS为基本培养基,利用L9(34)正交试验方法,筛选出6-BA、IBA、和AC三种因素在该试验阶段的适浓度组合,每种因素设计3个水平,分别为:6-BA (1.0、1.5、2.0 mg/L)、IBA (0.2、0.4、0.6 mg/L)和AC (2.0、4.0、6.0 g/L),共分为9个处理,每个处理接种15瓶,每瓶外植体接种数量为1。
2.2.3. 原球茎增殖及分化培养
本试验阶段同样以MS培养基为基本培养基,利用L9(34)正交试验方法,筛选出6-BA、IBA、和AC三种因素适宜促进增殖及分化的浓度组合,每种因素设计3个水平,分别为:6-BA (0.5、1.0、1.5 mg/L)、IBA (0.2、0.4、0.6 mg/L)和AC (0.5、2.0、4.0 g/L),共分为9个处理,每个处理接种15瓶,每瓶接种原球茎的数量为5块。
2.2.4. 原生国兰诱导生根试验
本试验阶段以1/2MS培养基为基本培养基,共设置4个处理,分别为:处理1 (1/2MS + AC 1.0 g/L)、处理2 (1/2MS + AC 1.0 g/L + IBA 0.2 mg/L)、处理3 (1/2MS + AC 1.0 g/L + IBA 0.4 mg/L)、处理4 (1/2MS + AC 1.0 g/L + IBA 0.6 mg/L),每个处理接种50瓶,每瓶接种组培苗的数量为5株。
各处理在加入相应浓度外源激素和AC的同时,还需加入等量的蔗糖(含量为3%)和琼脂(含量为5%),培养基配置完成后,统一调节ph至5.6~5.8,并在121℃下灭菌20 min,接种后的外植体应确保于相同条件下培养,培养温度为25℃~28℃之间,光照时间为12 h/d,光照前度为1500 lx~2000 lx。
2.3. 数据分析
2.3.1. 数据分析涉及的计算公式
诱导生成原球茎阶段、原球茎增殖和分化阶段、壮苗及诱导生根阶段均从接种之日起,每5 d观察1次,40 d统计原球茎增殖倍数,70 d后统计原球茎分化成苗结果。试验中所用到的计算公式如下:
公式1:原球茎诱导率(%) = 诱导出原球茎的外植体数/培养外植体数 × 100
公式2:原球茎增殖倍数 = (培养后原球茎个数 − 原球茎接种数)/原球茎接种数
公式3:原球茎分化率(%) = 分化的原球茎数/原球茎接种数 × 100
公式4:生根率(%) = 生根的小苗数/总小苗数 × 100
2.3.2. 正交试验数据分析方法
本试验采用L9(34)正交试验方法,共有3个水平(分别用水平A、水平B、水平C表示),每个水平下有三个因素(各因素为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3),正交试验组合后见表1,在正交试验分析中须计算K值(指标值之和)和R值(极差),计算公式为:
1) K1:123结果相加,456结果相加,789结果相加
2) K2:147结果相加,258结果相加,369结果相加
3) K3:159结果相加,348结果相加,267结果相加
4) R值:因素A下K最大 − K最小,因素B下K最大 − K最小,因素C下K最大 − K最小。
3. 试验结果与分析
3.1. 不同外源激素配比对原生国兰诱导原球茎生成的影响
通过对接种到含有不同外源激素配比的培养基上的外植体进行观察可知,10 d后接种外植体的基部开始出现膨大,这是即将生成原球茎的标志;20 d后部分外植体基部开始出现白色的原球茎;40 d左右可在接种的外植体基部周围发现大量的原球茎。观察表2和表3可知,由于9组处理的外源激素配比不同,最终可测得的诱导率具有很大差别,其中3号处理的原球茎诱导率最高,为92.9%,利用数据统计
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Table 1. Example of orthogonal test
表1. 正交试验分析例表
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Table 2. Effect of different hormone treatments on protocorm induction
表2. 不同外源激素配比对原球茎诱导的影响
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Table 3. Statistical analysis of protocorm induction
表3. 原球茎诱导试验统计分析
分析原理,可计算各因素诱导率的R值,结果显示IBA (22.5) > 6-BA (18.8) > AC (10.8),说明三种外源激素对诱导原生国兰生成原球茎都起到了较大的促进作用,其中又以IBA的促进作用最大;利用不同k值间的大小比较可知,6-BA最大的k值为k1 (71.0),IBA最大的k值为k3 (72.5),AC最大的k值为k2 (64.3),因此应选取组合3 (6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.6 mg/L + AC 4.0 mg/L)为本次试验的最佳外源激素组合。
3.2. 不同外源激素配比对原生国兰原球茎增殖和分化的影响
为了实现原生国兰组培快繁从试验阶段向大规模工业化生产转化,必须将实现原生国兰原球茎快速增殖作为研究重点。通过原球茎的不断增殖,可分化产生新的幼芽,每个幼芽经过培养可形成独立的植株,但由于培养基中养分有限,在同一培养基中原球茎不能无限增殖,因此应定时进行转接。诱导培养40 d后,分别将诱导生成的原球茎纵切成大小均匀的4块,并接种到用于增殖分化的培养基上,进行增殖分化试验。
经观察,接种在增殖培养基中的原球茎约在10 d左右开始出现萌动现象,当培养至20 d时可观察到明显的增殖现象,40 d经统计分析可知(见表4),原球茎的增殖倍数在2.6~7.3之间,继续培养有明显的芽分化现象产生,70 d时进行芽分化率统计(见表4),分化率在43.6%~96.6%之间。
综合分析表4和表5可知,由于9组处理的外源激素配比不同,最终可测得的诱导率具有很大差别。在增殖阶段,组合6的原球茎增殖倍数最大为7.3,3种因素在此阶段R值由大到小依次为:IBA (2.24) > 6-BA (1.04) > AC (0.50),因此IBA是影响原球茎增殖的最主要因素;利用不同k值间的大小比较可知,6-BA的增殖阶段最大k值为k2 (5.67),IBA的增殖阶段最大k值为k2 (5.47),AC的增殖阶段最大k值为k3(5.30),因此本次试验中原生国兰在原球茎增殖阶段最佳的外源激素配比为:6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.4 mg/L + AC 4.0 g/L。在分化阶段,原球茎分化率最高为96.6%,3种因素在此阶段R值由大到小依次为:IBA (30.43) > 6-BA (22.27) > AC (8.90),因此IBA和6-BA对分化阶段影响较大,且以IBA为主;利用不同k值间的大小比较可知,6-BA的分化阶段最大k值为k2 (76.40),IBA的分化阶段最大k值为k3 (76.33),AC的分化阶段最大k值为k1 (68.60),因此本次试验中原生国兰在原球茎分化阶段最佳的外源激素配比为:6-BA 0.4 mg/L + IBA 0.6 mg/L + AC 0.5 g/L。
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Table 4. Effect of different hormone treatments on protocorm multiplication and differentiation
表4. 不同外源激素配比对原球茎增殖、分化的影响
3.3. 不同激素配比对原生国兰生根的影响
增殖培养的原球茎生长至70 d左右,开始分化生成不定根,但此时生成的不定根较为细弱,且小苗苗高增长几乎停滞,这大大降低了移栽苗的成活率,因此在小苗生根前,必须进行壮苗培养,具体方法为:将增值培养时期由原球茎分化成的无根苗切割成单苗,并转入壮苗生根培养基。在4种不同配方的培养基中可观察到,10 d左右单苗与培养基接触部位开始膨大,并形成根原基,20 d左右可以观察到有不定根生成,且植株有明显增高,当生长至40 d后,统计4种不同配方培养基中单苗的生长状况(生根率、根粗平均值、根长平均值、苗高平均值、根数平均值),结果见表6。
由表6反映数据可知,处理3与其他处理相比,更能促进组培苗生根,与处理4相比,处理3仅苗高平均数略低,综合考虑,应选择处理3为适宜促进国兰生根的配方。因此,1/2MS + IBA 0.4 mg/L + AC 1.0 g/L为促进国兰生根的适培养基。
4. 试验总结及讨论
本次试验利用广西北部广泛生长的蕙兰侧芽作为组培快繁材料,利用正交试验方法,分别探究不同外源激素对外植体原球茎的诱导形成、增殖与分化、壮苗及生根的影响,从而筛选出在不同阶段适宜的外源激素配比。在原球茎诱导期适宜培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.6 mg/L + AC 4.0 mg/L;原球茎增殖期适宜培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.4 mg/L + AC 4.0 g/L;原球茎分化期适宜培养基为MS + 6-BA 0.4 mg/L + IBA 0.6 mg/L + AC 0.5 g/L;壮苗及生根阶段适宜培养基为1/2MS + IBA 0.4 mg/L + AC 1.0 g/L。利用正交试验中所得的R值比较可知,IBA和6-BA在原球茎诱导形成阶段和原球茎分化阶段的影响作用相对较大,在原球茎增殖阶段影响作用相对较小,两种外源激素相比较,IBA的影响作用更为明显。与另外两种外源激素相比AC在各阶段的影响相对较弱,但AC与酚类及其氧化物具有极强的亲和作用,而酚类及其氧化物又是导致外植体褐变的诱导物质,AC在外植体培养过程中可以起到很好的抗褐变作用 [4] ,因此各阶段中AC的含量也具有重要的影响。
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Table 5. Statistical analysis of protocorm multiplication and differentiation
表5. 原球茎增殖、分化试验统计分析
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Table 6. Effect of different hormone treatments on root
表6. 不同激素配比对原生国兰生根的影响
基金项目
桂林市科技成果转化与推广项目(2016011303-1)。