1. 引言
浸润转移是恶性肿瘤的生物学特性。近年临床病理学研究证实，在初诊时60.0%以上的患者已有颈部区域淋巴结转移，一些患者也可能从患侧转移至对侧颈淋巴结 [1] [2] [3] 。唾液酸化Lewis X (SLeX)即CD15s，是常用的肿瘤标志物CA19-9 (SLeA)的同分异构体，作为选择素(Selectin)的配体分子，两者结合可介导癌细胞与细胞外基质及内皮细胞的黏附作用，促进转移 [4] [5] 。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)属凝集素家族成员，与包括甲状腺在内的多种器官的细胞生长调节、分化以及恶性转化密切相关 [6] [7] 。本文采用免疫组化染色EliVisionTM plus两步法检测164例甲状腺乳头状癌组织SLeX和Galectin-3的表达，探讨它们与甲状腺乳头状癌浸润转移的关系。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
本研究的病例来自本院2009年3月至2016年2月行手术治疗的甲状腺乳头状癌患者164例，其中男53例，女111例；年龄17~75岁，平均(39.4 ± 11.9)岁。所有患者术前通过彩超、CT、磁共振等影像技术观察瘤体部位、大小、形态以及瘤体内部影像学特征，与周围组织关系及淋巴结转移状况；术中采用纳米炭混悬液作为甲状腺淋巴示踪剂，根据淋巴结黑染范围及癌灶局部情况，个体化确定甲状腺切除和颈淋巴结清除范围；肿瘤浸润腺体包膜、腺外组织或血管以及区域淋巴结转移等状况，由术后病理诊断及免疫组化结果对照术前影像学检查综合判定，其中，有浸润和有淋巴结转移者分别为99例和93例，无浸润和无淋巴结转移者分别为65例和71例。有浸润与无浸润患者、有淋巴结转移与无淋巴结转移患者之间年龄、性别差异无统计学意义。术中随机选取30例，切取距瘤体2 cm以上的同侧或对侧甲状腺视为癌旁组织作为对照组，与癌组织进行对比观察。治疗方案于2009年1月由医院伦理委员会批准，实施前患方签署知情同意书。
2.2. 纳入标准
1) 肿瘤直径 > 1.0 cm，针吸细胞学诊断、术中冰冻快速病理诊断、术后病理均确诊为甲状腺乳头状癌。
2) 术前未曾口服甲状腺素制剂、131I、激素、中药、硫脲类或咪唑类等与甲状腺疾病治疗有关的药物。
3) 术中证实未累及气管、食管。
4) 术前检查未发现肺、骨、脑等远处转移。
2.3. 排除标准
1) 直径 ≤ 1.0 cm的微小乳头状癌。
2) 术前曾接受针对甲状腺疾病的手术或药物相关治疗。
3) 合并甲状腺炎。
4) 伴发其他部位肿瘤或炎性疾病。
2.4. 手术治疗方法
单侧单灶癌直径 > 1.0 cm者，施行患侧腺叶全切除+峡部切除术、腺叶全切除+峡部切除+对侧腺叶次全/部分切除术，以及全甲状腺切除术；单侧多灶癌、双侧单灶或多灶癌、有明显腺外浸润或区域淋巴结转移者，施行近全甲状腺切除或全甲状腺切除术。对高危患者施行功能性颈淋巴结清除术(functional neck dissection, FND)或简化的FND，对中危、低危患者施行选择性颈淋巴结清除术(selective neck dissection, SND) [2] 。术中应用纳米炭混悬液淋巴示踪技术有助于保障淋巴结清除的彻底性和安全性。
2.5. 免疫组化染色方法
手术标本均行常规HE染色。取相邻切片行免疫组化染色。即用型鼠抗人SLeX和Galectin-3单克隆抗体、EliVision试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。所有标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规制备4 μm厚连续切片，65℃烘烤备用。免疫组化染色采用EliVisionTM plus两步法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行 [8] [9] [10] [11] [12] 。阳性对照由福州迈新生物技术有限公司提供，阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗制作。
2.6. 判定标准
阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色，由2位有经验的病理医师在光学显微镜下进行双盲观察。按细胞有无染色及染色深浅强度评分：无染色0分，棕黄色1分，棕褐色2分；按染色细胞所占比例记分：≤30% 1分，31%~70% 2分，≥71% 3分。每例积分为两项计分之和，按积分高低定性为3级：0分阴性(−)，1~3分弱阳性(+)，4~6分强阳性(++)。弱阳性和强阳性均计为阳性。
2.7. 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件对数据资料进行统计分析，计量资料用(
± s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验与列联系数相关分析，检验水准α = 0.05。
3. 结果
3.1. SLeX和Galectin-3在癌组织及癌旁组织中的表达
癌组织中SleX阳性染色主要见于细胞质和细胞膜，其总体阳性表达率为70.7% (116/164)，其中强阳性表达率为38.4% (63/164)，弱阳性表达率为32.3% (53/164)，阴性表达率为29.3% (48/164)；癌旁甲状腺组织中SLeX总体阳性表达率为6.7% (2/30)，其中强阳性表达率为0(0/30)，弱阳性表达率为6.7% (2/30)，阴性表达率为93.3% (28/30)。癌组织与癌旁甲状腺组织比较，总体阳性表达率(χ2 = 43.683)、强阳性表达率(χ2 = 17.067)、弱阳性表达率(χ2 = 8.214)之间差异均有统计学意义(P < 0.05) (见表1)。
癌组织中Galectin-3阳性染色主要见于细胞质，其总体阳性表达率为92.1% (151/164)，其中强阳性表达率为76.8% (126/164)，弱阳性表达率为15.2% (25/1164)，阴性表达率为7.9% (13/164) ；癌旁甲状腺组织中Galectin-3总体阳性表达率为20.0% (6/30)，其中强阳性表达率为6.7% (2/30)，弱阳性表达率为13.3% (4/30)，阴性表达率为80.0% (24/30)。癌组织与癌旁甲状腺组织比较，总体阳性表达率(χ2 = 85.351)、强阳性表达率(χ2 = 53.016)之间差异均有统计学意义(P < 0.05)，而弱阳性表达率(χ2 = 0. 073)之间差异无统计学意义(P > 0.05) (见表1)。
3.2. SLeX和Galectin-3表达与癌组织浸润及淋巴结转移的关系
有包膜、腺体外组织或血管浸润与无浸润患者SLeX总体阳性表达率分别为84.8% (84/99)和49.2% (32/65)，其中强阳性表达率分别为49.5% (49/99)和21.5% (14/65)，弱阳性表达率分别为35.4% (35/99)和27.7% (18/65)，阴性表达率分别为15.2% (15/99)和50.8% (33/65)。两者比较，SLeX总体阳性表达率(χ2 = 24.045)、强阳性表达率(χ2 = 12.963)之间差异均有统计学意义(P < 0.05)，弱阳性表达率(χ2 = 1.053)之间差异无统计学意义(P > 0.05)。有浸润与无浸润患者Galectin-3总体阳性表达率分别为98.0% (97/99)和83.1% (54/65)，其中强阳性表达率分别为84.8% (84/99)和64.6% (42/65)，弱阳性表达率分别为13.1% (13/99)和18.5% (12/65)，阴性表达率分别为2.0% (2/99)和16.9% (11/65)。两者比较，Galectin-3总体阳性表达率(χ2 = 11.940)、强阳性表达率(χ2 = 9.023)之间差异均有统计学意义(P < 0.05)，弱阳性表达率(χ2 = 0.862)之间差异无统计学意义(P > 0.05) (见表1)。
Table 1. Expression of SLeX and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma and para-tumorous tissues
表1. SLeX和Galectin-3在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中的表达
有区域淋巴结转移与无转移患者SLeX总体阳性表达率分别为89.2% (83/93)和46.5% (33/71)，其中强阳性表达率分别为50.5% (47/93)和22.5% (16/71)，弱阳性表达率分别为38.7% (36/93)和23.9% (17/71)，阴性表达率分别为10.8% (10/93)和53.5% (38/71)。两者比较，SLeX总体阳性表达率(χ2 = 35.574)、强阳性表达率(χ2 = 13.345)之间差异均有统计学意义(P < 0.05)，弱阳性表达率(
= 3.367)之间差异无统计学意义(P > 0.05)。有淋巴结转移与无转移患者Galectin-3总体阳性表达率分别为96.8% (90/93) 和85.9% (61/71)，其中强阳性表达率分别为81.7% (76/93)和70.4% (50/71)，弱阳性表达率分别为15.1% (14/93)和15.5% (11/71)，阴性表达率分别为3.2% (3/93)和14.1% (10/71)。两者比较，Galectin-3总体阳性表达率(χ2 = 6.505)之间差异有统计学意义(P < 0.05)，而强阳性表达率(χ2 = 2.887)和弱阳性表达率(χ2 = 0.006)之间差异均无统计学意义(P > 0.05) (见表1)。
3.3. SLeX和Galectin-3表达的相互关系
SLeX阳性表达的116例中Galectin-3均为阳性表达(100%)，SLeX阴性表达的48例中Galectin-3阳性表达35例(72.9%)。甲状腺乳头状癌组织中SLeX与Galectin-3表达具有一定正相关性(r = 0.41)见表1。
4. 讨论
甲状腺乳头状癌是4种甲状腺癌中最常见的临床病理类型，几乎所有的儿童甲状腺癌和70%~80%以上的成人甲状腺癌均为此种类型，其发病率近年来呈快速增长趋势 [13] [14] [15] 。尽管大多数患者癌组织分化较好，病程较长，但近年研究发现，不少患者癌组织仍具有较高的局部浸润性和区域淋巴结转移率，在6组淋巴结中，中央组(Ⅵ区)淋巴结是最常发生转移的部位 [3] [16] 。因此，采用肿瘤标志物研究甲状腺乳头状癌组织及其转移淋巴结中的表达状况，有助于加强对癌组织生物学特性、尤其是浸润能力和转移潜能的判断，对评估患者预后、随访中及时发现复发、指导临床施行再次手术等综合治疗具有一定意义 [17] [18] 。
由黏附分子介导的细胞与细胞、细胞与基质的相互作用，是癌瘤浸润和转移的生物学基础之一。作为一类细胞黏附分子，LeX和SLeX可分布于胚胎组织及肿瘤细胞表面糖脂及糖蛋白上，其表达状况的变化与恶性肿瘤浸润、转移及复发具有显著相关性 [19] [20] ，对鉴别甲状腺良恶性疾病具有较高的特异性 [21] 。SLeX属Lewis血型决定簇Ⅱ型抗原，是一种四糖碳水化合物，其合成由岩藻糖转移酶介导，主要由岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc) 5个分子组成，通过调节性T细胞等参与机体免疫反应 [22] 。近年研究表明，SleX阳性表达的癌细胞通过结合含有选择素的血小板、粒细胞及内皮细胞，与细胞外基质及血管内皮细胞发生黏附作用，是癌细胞浸润及转移过程中的重要途径之一，即癌细胞Lewis-Selectin转移途径 [4] [5] [23] 。本研究结果表明，SLeX在甲状腺乳头状癌组织中的总体阳性表达率、强阳性表达率和弱阳性表达率均显著高于癌旁甲状腺组织，存在包膜、腺体外组织或血管浸润和伴有区域淋巴结转移者，其阳性表达率均显著高于无浸润和无淋巴结转移者，表明SLeX与甲状腺乳头状癌的恶性发展、浸润、转移密切相关，其高水平表达的癌肿浸润性强，转移率高，生存率低。
普通病理对典型甲状腺乳头状癌的诊断并无困难。当甲状腺瘤或结节性甲状腺肿伴滤泡上皮乳头状增生或非典型性改变时，与乳头状微小癌的鉴别则成为病理诊断的难点。在实际工作中较少见到具有典型乳头状结构的微小癌，有些良性病变即使具有典型的癌性乳头状结构，也会因缺乏典型的核特征而困扰鉴别诊断。Galectin-3是半乳糖凝集素家族β-半乳糖苷结合蛋白，其C端与Bcl-2家族的BH1域都含有抑制凋亡活性的关键结构NWGR (Asp-Trp-Gly-Arg)基序，通过增加肿瘤细胞随血液传播能力促进其浸润与转移 [7] [24] 。近年研究发现，Galectin-3与细胞角蛋白19同时呈阳性表达的甲状腺良性病变具有较高的癌变潜能，采用免疫组化方法检测Galectin-3，对乳头状微小癌的鉴别诊断有较大帮助 [25] [26] [27] [28] 。本研究结果表明，Galectin-3在甲状腺乳头状癌组织中的总体阳性表达率和强阳性表达率均显著高于癌旁甲状腺组织，而弱阳性表达率差异无统计学意义，表明Galectin-3在甲状腺乳头状癌中的表达大多数呈强阳性，在癌旁甲状腺组织中表达大多数为阴性、弱阳性。两者之间的不同表达，证实它在甲状腺良恶性病变的鉴别诊断中具有较可靠的应用价值。与SLeX结果一样，存在包膜、腺体外组织或血管浸润和伴有淋巴结转移者，其阳性表达率均显著高于无浸润和无淋巴结转移者，表明Galectin-3参与了癌细胞生长和凋亡、细胞黏附、新生血管形成和肿瘤浸润转移等，在肿瘤的发生、发展过程中的不同阶段发挥了重要作用。
在观察SLeX和Galectin-3表达的相互关系中发现，两者具有一定的正相关性，提示它们在甲状腺乳头状癌的恶性发展过程中可能具有协同调节作用。深入探讨SLeX和Galectin-3在甲状腺乳头状癌浸润、转移过程中的作用机制，必将有助于更全面了解癌肿的临床病理进程，进而为研发对甲状腺乳头状癌浸润转移具有有效抑制作用的靶向治疗等新药物提供理论依据 [29] [30] 。
5. 结论
SLeX和Galectin-3在甲状腺乳头状癌组织中多数呈强阳性表达，显著高于非癌组织，两者与癌组织浸润转移密切相关，联合检测有助于评估患者预后。深入研究两者在甲状腺乳头状癌发生发展过程中的作用机理，有助于研发新的靶向治疗药物。但由于恶性肿瘤发生发展的各个时期常常与多种功能不同的癌基因和/或抑癌基因的异常表达有关，故而仅仅依靠此两种标志物尚难全面评估甲状腺乳头状癌的临床病理进程。