1. AOC的概念、意义及标准测定方法
饮用水分配系统和储存系统中的细菌生长会导致水质的恶化，使水质无法达到标准，并且增加生产成本。消毒过程中存活的细菌可以利用水中和生物膜中的营养生长或再生长。并不是所有的有机化合物都易被微生物分解，有机化合物中能提供细菌生长所需碳源并且被转化为生物质的部分称为可同化有机碳(Assimilable organic carbon, AOC)。
可同化有机碳(AOC)是指限制异养微生物生长的有机化合物，如氨基酸和有机酸等，分子量一般小于1000 Da, Van der Kooij等人 [1] 于1982年首先提出了这个概念。与之相对应的测定可同化有机碳的方法称为AOC生物测定。AOC [2] 是饮用水中可溶解有机碳(DOC)可作为微生物生长所需碳源和能源的一小部分，并且反映微生物再生的可能性，即生物稳定性。众所周知，AOC是测定水的生物稳定性的重要指标。目前，AOC生物测定已应用于水处理，配水系统，再生水处理和海水脱盐等，并且推动了水质分析的研究进展。
由于AOC是由多种化合物组成的复杂混合物，并且通常少量存在于水中。所以，与化学方法测定总有机碳(TOC)和可溶解有机碳(DOC)相比，AOC测定是更加复杂的生物方法。Van der Kooij [1] 用荧光假单胞菌P17和螺旋菌sp. NOX作为测试菌种进行AOC的测定。P17和NOX都是存在于配水系统中，可以利用水中低浓度有机碳化合物的常见细菌。P17和NOX只需要简单的氮源，并且不需要类似维生素的生长刺激物，就可以在固体培养基上快速生长得到可分辨的克隆。此外，P17和NOX在实验室中易于以纯培养物的形态保存。P17可以利用除了草酸外的多种营养，而NOX可以利用一些特殊的化合物，例如草酸。在AOC生物分析中，由于P17与NOX能够利用不同的营养，故把它们放在一起作为检验细菌。在AOC分析中，用不同浓度的醋酸或草酸盐来培养测试细菌，由盐浓度和细菌最大生长数可得到一条标准曲线，得到一条线性相关的直线，由此可导出生长因子Y和盐浓度的公式。AOC生物分析就是基于细菌在水中从接种生长至稳定阶段的最大生长量与AOC浓度的线性关系。AOC生物分析通常是终点测定，并且水样在接种前应进行巴氏消毒，细菌需要长期培养使检验细菌达到最大生长值 [3] 。所以AOC生物分析是一个耗时长，复杂并且费力的过程 [1] ] [4] ] [5] ，如图1所示。因此，如何缩短测定过程并且简化工序对AOC生物分析来讲是一个重要的问题。国内外已有多篇关于AOC测定的综述，本文重点介绍近十年来的研究发展。
Figure 1. The standard flow chart of AOC biological analysis
图1. AOC生物分析标准流程图[1] [5] [6]
2. AOC生物分析的进展
AOC生物分析的进展如表1所示。
2.1. 菌种的选择
由于AOC生物分析是基于在巴氏消毒过的水中细菌的生长，所以测试细菌的选择和表征十分重要。一些研究利用单一菌种、混合菌种或者本土菌种进行测定。由于缺少外酵素和不同细菌之间的交互作用，单一的纯菌种不能完全利用水中的AOC，所以Van der Kooij [1] ] [6] 在单一菌种P17 (荧光假单胞菌)中加入NOX (螺旋菌)来扩大营养利用的多样化。Kemmy [7] 选择了包括P17在内的四个特殊菌种来测定水中的AOC值，细菌在生长五天后达到极限，因此与传统AOC生物分析相比可缩短培育周期。Zhao Xin等人 [8] 使用G3, ZJ2, G6与P17和NOX共同作为测试菌种，用于再生水的AOC测定。由于ZJ2和G3可以更好的利用聚合物和糖类，G6可以利用更多的胺类和糖类，所以可以更快更准确地得到再生水中的AOC值。E.LW.Sack等人 [9] 在贫瘠水环境中挑选出了一种新的AOC菌种(A3)，可以利用淡水中浓度为微克每升的多种化合物，包括低聚糖、多糖，可以弥补P17和NOX无法利用低浓度的多糖和低聚糖的不足，进一步扩大测试细菌的营养多样性。Werner [10] ，Sathasivan [11] 和Hammes [4] 分别使用本土微生物作为培养菌种进行研究。虽然本地微生物在AOC生物分析中可以更全面的利用AOC，但是利用大分子有机化合物仍需要复杂的胞外酶和多种细菌之间复杂的交互作用。并且作为检测AOC的指标，菌种的必要特性必须是重复且可比较的。目前，由于本地菌种有许多未定特性，且其生长速率受碳浓度、PH及温度等条件影响，使定量更复杂，所以难以满足上述必要条件，尚难以标准化。
Table 1. Research progress on the AOC biological analysis
表1. AOC生物分析的研究进展
2.2. 接种条件和培育条件的优化
有关优化接种条件和水样培养条件的研究主要集中于，细菌培养液的选择，水样的预处理和培养条件的优化。Kaplan [3] 提出用40 ml的市售无有机碳的硼硅玻璃小瓶代替1 L烧瓶，增加了反应的面积与体积比，使AOC值提高，并且这种小瓶易于操作和运输，简化了AOC分析实验的操作。此外Kaplan还建议在对水样巴氏消毒前，用无碳玻璃纤维过滤器除去大部分的颗粒有机碳。Le Chevallier等人 [5] 通过提高培养温度至25℃，同时增加培养物浓度至104 CFU/mL，可使细菌在2-4天内生长至稳定期，缩短了实验周期。Escobar [12] 优化了水样的储存条件，研究表明样品在72℃加热30分钟后马上冰浴30分，之后储存于4℃，样品的AOC值至少七天内不会有显著变化。Miettinen等人 [13] 发现无机物营养，尤其是磷可能限制饮用水中的微生物生长。在富含腐殖质的软饮用水中添加无机营养物(N, P, K, S, Ca, Mg)会增加AOC产量，消除磷的限制。
国外接种P17和NOX主要有三种方法；第一种方法将水样分为两份，分别接种P17和NOX，将测定结果相加作为总的AOC，该方法称为分别接种法 [6] ；第二种方法在水样中同时接种P17和NOX，根据两种菌的形态与大小不同分别对其计数，这种方法称为同时接种法 [3] ：第三种方法在水样中先接种P17，待其生长至稳定期计数，过滤水样后接种NOX，培养至稳定再进行计数，然后将P17细菌数和NOX细菌数分别转化为AOC-乙酸浓度和AOC-草酸浓度，该方法称为先后接种法 [14] 。在国内，刘文君等人 [15] 对第三种接种方法进行改进，P17生长至稳定期后，巴氏消毒杀死P17，然后再接种NOX进行培养。此外，刘文君等人对三种接种方法进行比较。总结得到，同时培养法和连续培养法对AOC生物分析优于分别接种法，但分别接种法与同时接种法比先后培养法用时短，而同时接种法易受稀释倍数影响。所以在对水样浓度范围了解时可使用同时培养，连续培养更利于不同水样间的横向比较。
桑军强等人 [16] 认为基于刘文君的传统AOC分析忽略了磷对P17和NOX生长的影响，在实验过程中引入了一定数量的外来磷，不能够客观地反映细菌在待测水样中的再生能力。研究对刘文君等人的连续培养测定AOC值的传统工艺进行了改进，通过降低接种液中K2HPO4和KH2PO4的浓度并去掉稀释溶液中的磷酸盐以避免将额外的磷引入水样，使得到的AOC值更客观地反映出水样的营养情况。
方华等人 [17] 优化了AOC分析操作条件，并且提出了由不同的醋酸盐浓度导出计算有机物产率系数的改良方法，该方法的适用范围为10~300微克每升的醋酸盐。白晓慧等人 [18] 优化了先后接种法的接种和培养条件，同时得到了AOC-NOX修正计算公式，减去了连续培养过程中由于P17细胞裂解引起的AOC增量，使测定结果更加准确，并且使测定时间缩短一天。
2.3. 细菌生长测定方法的改进和展望
目前，AOC生物分析可以通过平板计数法，浊度法，ATP冷光法，CheckLight试剂盒，和流式细胞技术等方法来测定菌落和细胞数量或其它等值量，从而得到细菌的生长情况。
ATP即三磷酸腺苷存在于所有活的生物体中，容易被储存和利用，是活细胞新陈代谢的能量源泉。当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失。基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，可反应细胞的存活状况，即ATP浓度与活细胞的数量密切相关。LeChevallier等人 [5] 将ATP冷光法引入AOC生物分析。待P17和NOX生长至稳定期后，用荧光素–荧光素酶对其进行标记，通过生物发光仪测得ATP含量即可得到细菌数量。LeChevallier的研究表明，利用ATP得到的细胞含量与用传统的平板计数法测得的细胞含量有较好的相关性，并且可以将测试时间减少到2~4天。
Haddix等人 [19] 用P17和NOX的生物发光衍生物作为测试细菌，可在水样中细菌生长至稳定期之前便利用细菌的早期发光峰值作为生理指标，得到细胞数量，进一步缩短测试时间。Haddix用平板法分别利用天然和生物发光的P17和NOX对36个水样进行AOC分析，得到的结果没有明显差别，说明该P17和NOX的生物发光衍生物保留了AOC分析能力。此外，Weinrich等人 [20] 利用P17和NOX的生物发光衍生物作为再生水AOC生物分析的培养物，并利用该方法探究水中的微生物生长和变化。
Weinrich等 [21] 利用哈维氏弧菌，一种可以发冷光的海洋微生物，其能够利用氨基酸，羧酸，碳水化合物，醛和醇作为营养。可作为海水的AOC生物发光法的测试细菌，该细菌使AOC生物分析的应用从淡水扩大到海水。Sanghyun [22] 建立了一个新的测定海水AOC的方法，该方法基于海洋细菌–费希尔弧菌的生物体之发光，能够更快更准确的得到海水的AOC值，并可作为海水生物淤积潜能的指示器。Quek等人 [23] 建立了一种利用生物电化学传感器快速检测海水中AOC值的方法，利用在阳极电极上生长的微生物，能够将来自溶液中氧化有机物的电子转移至阴极电极而产生电流。该方法可以在5分钟之内测得低醋酸盐浓度海水的AOC值，并且结果可重复，可有效地作为海水反渗透系统的生物淤积潜能指示器。
刘路等人 [24] 引进了一种ChckLight AOC试剂盒。利用海洋发光细菌–费希尔弧菌，该细菌一旦遇到AOC，就开始发光，发光强度取决于水样AOC的浓度，发光亮随时间而增加，由此可得到AOC值。该试剂盒可以在2~3小时内完成AOC的测定，但是水样的质量及检测时间对AOC值影响较大，准确性和可靠性还需进一步验证，并且测试费用比传统的AOC生物分析高很多。
Hemmes [4] 用SYBR green荧光染料对P17的全部核酸进行染色，用流式细胞仪进行细胞计数，代替平板计数法，可将检测时间由三天减至15分钟。除此之外，Hemmes还用该方法研究了天然微生物菌群，并且建立了可利用AOC的天然微生物菌群的完整生长曲线。Srijan等人 [25] 比较了染色–流式细胞术，无染色–流式细胞术，粒子计数法三种方法在AOC生物分析中的可行性。研究发现，染色–流式细胞术在AOC分析中可以快速准确的对P17和NOX行计数；无染色–流式细胞术对NOX无法进行准确的计数，但是得到的结果与传统平板计数法有线性相关性；粒子计数法对P17计数与传统计数得到的结果有线性相关性。无染色–流式细胞术和粒子计数都过高估计了AOC值，染色–流式细胞术在AOC分析中可以快速的对P17和NOX进行计数。Elhadidy [26] 利用流式细胞仪与天然微生物菌群监测地表水的AOC值，并进行长期的水质研究。结果表明，利用流式细胞术得到的AOC结果可靠，可重复，并且比得上传统的平板计数方法。除此之外，该方法还可分辨高核酸细菌和低核酸细菌。
在AOC生物分析中，细菌生长的测定从平板计数法发展到ATP发光法和流式细胞术等。与传统的平板计数法相比，流式细胞术得到的数据更稳定，这是由于平板计数易受人为误差或细菌生理变化的影响。与ATP发光法相比，流式细胞术更灵敏并且不易受背景干扰。ATP发光法测定的是与细胞数相关的ATP值，结果需经过两次数值转换得到AOC值，并且不同的细胞在不同的生长阶段ATP浓度都不相同。与ATP发光法相比，流式细胞术则可直接测定细菌的数值变化。
在AOC生物分析中，测定方法的进展可以更方便的了解细菌的生长动力学。Van der Kooij通过测定纯培养物进行生长动力学研究。在此之后，Weinrich [20] 和Hammes [4] 等人分别利用生物体发光法和荧光染色—流式细胞术分析AOC测定中的细菌生长动力学。Hammes总结，仅利用测定细胞数量得到的总生物生长量会稍许偏高。Weinrich等人建立了一个快速计算细菌最大生长量的模型。然而，ATP方法降低了准确性，而流式细胞计数是利用细胞数而不是细胞体积作为参数，由于细胞的尺寸不同，细胞数不能准确的定量评估AOC。在AOC生物分析中，由于细菌生长动力学可以模拟水中细菌的生长，所以具有重大的意义，并引起越来越多的关注，但仍需要测定方法的进展去完善AOC细菌的生长动力学。
3. 结论与展望
自从被提出以来，AOC生物分析得到了广泛的认可和关注，是国际间公认的衡量水生物稳定性的重要指标之一。随着国内外科学家的研究的开展，AOC生物分析取得了巨大进展。然而，AOC生物分析仍存在耗时长、工序复杂、重复性差等问题。在菌种的选择上，由于被广泛使用的P17和NOX生长温度偏低，在一些热带或亚热带地区，本地的细菌可能会更好地表征当地的水环境，并且较高的生长温度可能缩短培养时间，不过新菌种有许多未知的性质，对其标准化需要进行长期的验证和大量的工作。另一方面，由于NOX的生长速度极慢，在水中生长至稳定期需要的时间远长于P17，是决定检测时间的因素之一，故可通过UV、热激或化学等手段对NOX进行非定向诱变，筛选出生长速度快并且保留了其营养特性的菌种。未来的工作仍可对接种和培育条件进行优化，使得到的AOC值更加客观准确，并在一定程度上减少分析所需时间，但难以大幅度地对其进行缩减。从目前的研究进展可知，检测方法的改进能够较大程度地减少测试时间并简化工序，并且有潜力标准化，应用于实际水质监测。其中流式细胞术具有快速、稳定、易操作的特点，并且可以提供完整的细胞动力学生长数据，优于其它的测定方法。但是目前的研究只能用荧光染料对P17进行染色后检测，染色需要额外的工序，且染色剂的使用会增加检测成本。除此之外，由于P17与NOX同时培养时，无法对其分别染色，只能培养单一菌种并进行染色计数，得到的AOC值只与单一菌种有关，不够全面与准确。未来的研究可以将重点放在获得P17和NOX的不同荧光衍生物，免除染色步骤上，并且可以同时培养P17与NOX后用流式细胞仪并分别对其进行准确的计数，由此得到更客观的AOC值。