1. 前言
三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)又称Krebs循环,是需氧生物体内普遍存在的代谢途径,是糖类,脂类和蛋白质三大营养物质代谢的联系通路 [1] 。真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是三羧酸循环进行的场所。在真核生物中,柠檬酸转运载体是一类定位于线粒体膜上的载体蛋白,负责介导乙酰辅酶A由线粒体转运至细胞质,参与三羧酸循环,将三大营养物质经氧化磷酸化彻底氧化成二氧化碳和水并释放能量保证机体代谢的顺利进行,同时乙酰辅酶A也可以作为中间物质参与到糖类,脂肪酸及其它代谢物质的合成通路 [2] 。柠檬酸转运载体家族具有许多种类,自从1972年第一个柠檬酸转运载体蛋白从大鼠肝脏线粒体被纯化出来 [3] ,到现在已有多种该类蛋白分别从人,大鼠,鳗鱼和酵母中被提取出来 [2] [4] [5] [6] 。虽然部分柠檬酸转运载体基因及蛋白一级结构已经被解析,但对其功能研究大多是在哺乳动物中进行的 [7] [8] ,对昆虫体内CiC的功能研究相对较少。
保幼激素是由昆虫咽侧体产生的一种倍半萜类化合物,其主要功能是分泌到血淋巴保持幼虫的特性、维持前胸腺和促进卵巢成熟,调控昆虫的发育、变态和生殖等 [9] [10] [11] 。在昆虫体内,存在多种保幼激素的同源物 [12] ,其中,保幼激素Ⅲ(JH III)最为普遍,其合成途径为:乙酰辅酶A→甲羟戊酸→异戊烯醇焦磷酸→法尼焦磷酸→法尼酸→保幼激素III。在该过程中,多种关键酶精确调控每一步化学反应,影响JH III合成。例如3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase, HMGR)和保幼激素酸甲基转移酶(Juvenile hormone acid methyl transferase, JHAMT)的活性均与JH合成呈线性关系 [13] 。虽然JHⅢ合成过程已研究的较为详尽,但作为介导JH合成最初底物乙酰辅酶A跨膜运输的CiC是否会影响JH的合成,目前还没人在模式昆虫太平洋折翅蠊中进行研究。因此本实验选择太平洋折翅蠊这一生活害虫为研究对象,对CiC与JH合成的关系进行了探究,不仅可以进一步解析昆虫JH合成通路,又能够为有害昆虫防治提供理论基础。
2. 实验材料与方法
2.1. 昆虫饲喂
太平洋折翅蠊在实验室恒温27摄氏度的黑暗环境中饲喂培养,为了得到同时期材料,新蜕皮的雄性与雌性成虫挑出来分开培养取材。
2.2. 实验方法
2.2.1. 组织收集和RNA提取
取D. punctata在解剖显微镜下,于缓冲液(150 mM NaCl, 12 mM KCl, 10 mM CaCl2∙2H2O, 3 mM MgCl2∙6H2O, 10 mM HEPES 94, 40 mM glucose, pH 7.2)中解剖组织,样品迅速用液氮冷冻,放于−80℃保存。对每一个解剖的雌性样品,通过测量初级卵母细胞长度来决定生理周期。为了测定不同组织中的CiC基因表达图谱,选择交配后4天的成虫的脑(Brain, Br),咽侧体,脂肪体,中肠(Midgut, MG),马氏管(Malpighian tubules, MT),神精索(Nerve cord, NC)和卵巢(Ovaries, OV)取样,每个样品取10头昆虫的该组织,取3个独立的生物学重复。为了得到咽侧体中不同时期的CiC基因表达图谱,取交配后0-7天的雌性成虫咽侧体组织,每天在相同时间点取样,每个时间点取3次独立的生物学重复,每个重复包括十头昆虫。将取好的样品按照RNeasy Mini Kit (Qiagen)说明书提取组织总RNA。由于咽侧体组织较少,故用RNAqueous®-Micro Kit (Ambion)进行RNA提取,提出的RNA用Dnase处理后用NanoDrop 2000c分光光度计检测浓度,选择A260/280在1.8~2.0的RNA样品进行反转录。
2.2.2. 反转录合成cDNA
按照反转录试剂盒(Qiagen)说明书合成cDNA:首先去除RNA中混有的DNA,加入总RNA 1 μg,5× gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,无RNA酶水5 μL,在42℃的条件下反应3 min,迅速置于冰上。另取新管加入Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL,FQ-RT Primer Mix 2 μL,10× Fast RT Buffer 2 μL,无RNA酶水5 μL混匀后将上述两个体系混合,共20 μL,然后按如下条件进行反应:42℃ 15 min,95℃ 3 min,4℃ 5 min,反应结束后得到cDNA,−20℃保存。
2.2.3. 实时定量PCR
qRT-PCR反应体系:2 × SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物(引物浓度10 mmoL/L)各0.8 μL,cDNA 2 μL,超纯水6.4 μL;总体系20 μL。反应条件:95℃预变性30s;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 30 s,共40个循环;熔解曲线设定为70℃与95℃,以验证产物的特异性。每个样品均做3个技术重复,以保证试验数据的准确性,β-Tubulin作为内参,定量引物如下:
2.2.4. RNA干扰
用干扰引物以咽侧体cDNA为模版扩增基因片段用于双链RNA载体构建。在同一基因的不同区域扩增两个不同片段以确保干扰效果。双链RNA使用MEGAscriptRNAi kit (Ambion)按照说明书合成。
RNA使用T7启动子进行转录,37℃过夜反应。反应产物用DNase I和R Nase处理后,根据说明书用固相吸附柱纯化,得到的双链RNA浓度用NanoDrop2000c分光光度计进行检测,完整性和聚合度通过跑1.2%的琼脂糖电泳进行检测。阴性对照使用pJET基因的非编码区为模版进行RNA双链合成。然后选用新蜕皮的交配过的雌性昆虫进行双链RNA注射,HMGR双链RNA在第0天与第2天注射,JHAMT双链RNA在第1天与第3天进行注射,注射剂量均为每头3 μg,咽侧体组织在第4天进行收集。
干扰引物如下:
3. 结果与讨论
为了检测CiC在D. punctata组织中的分布情况,对交配后四天的雌性与雄性的脑,咽侧体,脂肪体,中肠,马氏管,神精索和卵巢中CiC mRNA表达量利用实时定量PCR技术进行测定,结果显示CiC在咽侧体和脂肪体具有很高的表达量,在其他组织中表达量较低,其中在咽侧体中表达量最高,在中肠中表达量最低(如图1)。在人类CiC分布研究中,CiC在肝脏,肾脏和胰腺中具有高表达,在心脏和骨骼肌中表达量偏低,而在脑和肺中几乎未检测到CiC表达 [14] 。人体肝脏是脂肪酸合成的主要场所,需要大量乙酰辅酶A作为合成底物,故而CiC表达量最高,以满足对乙酰辅酶A从线粒体转运至细胞质参与反应的需求。在太平洋折翅蠊中,咽侧体是合成保幼激素的腺体,脂肪体是合成昆虫脂肪酸的场所,这两个过程均需消耗大量的乙酰辅酶A,所以与人类肝脏线粒体类似,咽侧体线粒体中CiC也维持在较高水平,而中肠并不参与上述合成过程,CiC水平也较低。这一结果说明CiC通过转运JH合成底物乙酰辅酶A参与到了JH合成途径,对JH合成有一定影响。
为了研究CiC与JH合成在咽侧体发育过程中的变化趋势,取交配后0~7天的咽侧体材料,对CiC表达量进行测定,结果CiC表达量在0~4天时均呈上升趋势,在4天时CiC表达量达到最高值,在4~7天呈下降趋势(图2)。而在相同处理的咽侧体中,JH释放量与CiC表达量在上升与下降过程中趋势大体相似 [15] ,表明CiC参与JH合成,CiC高表达可以促进JH合成。第二天JH合成量较第一天上升时,CiC表达量出现短暂下降。我们推测原因可能是由于太平洋折翅蠊中CiC有许多种类,在JH快速合成时,我们研究的这种CiC已经无法满足JH合成对乙酰辅酶A的转运需求,因此另一种或几种转运效率更高的CiC开始大量合成并发挥作用,这些蛋白的突然大量表达,可能会对其它同源蛋白的表达产生短暂影响。
所以我们检测的CiC表达量可能会出现短暂降低。
为了进一步验证CiC与JH合成之间的关系,我们利用RNAi技术对JH合成通路中已知的两个关键酶 HMGR和JHAMT基因进行干扰 [13] ,二者分别影响JH合成通路中甲羟戊酸与甲基法尼脂的合成 [15] 。
在JH合成大幅降低的情况下对咽侧体中的CiC表达量进行测定。实验结果显示:与对照组相比,处理组CiC表达量降低了48% (如图3),存在极显著差异。因此,我们推测在JH合成受阻的情况下,咽侧体可能存在一种反馈调节机制可以反向调节咽侧体中CiC的表达量,减少乙酰辅酶A的跨膜外运,维持胞质中乙酰辅酶A与JH合成速率的平衡。从而进一步证明CiC与JH合成通路具有紧密联系。
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Figure 1. Tissue distribution of CiC in different tissues of the cockroach, D. punctata.
图1. 太平洋折翅蠊不同组织中CiC的表达量分布
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Figure 2. Expression of CiC and release of JH in CA of the first gonadotrophic cycles, mated female from day 0 - 7. Release of JH was cited from reference [15]
图2. 交配后不同时期咽侧体CiC表达量与JH释放分布图,JH释放引自参考文献 [15]
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Figure 3. The expression of CiCin the corpora allata of cockroach
图3. 咽侧体中CiC表达量
4. 结论与展望
柠檬酸转运载体在保幼激素合成器官咽侧体中具有高表达,并且在咽侧体中表达量与JH释放量的变化趋势大致相似,说明经由柠檬酸转运蛋白跨膜运输的乙酰辅酶A参与到了昆虫保幼激素合成途径。同时,乙酰辅酶A又是三大营养物质代谢的中间产物,对昆虫的三大物质循环和能量代谢至关重要。因此,CiC对昆虫生长与发育也发挥重要作用。如今,病媒生物控制是一个全球性的问题,在世界重大疾病预防控制中占据重要地位,是对病媒生物性传染病,特别是对尚无有效疫苗控制的病媒生物性传染病一个非常重要的防控手段。蟑螂是四大生活害虫之一,是多种病原微生物的传播媒介,可以引发多种传染病,并且具有种类多,分布广,繁殖快,生存能力强,危害性大,难根除等特点。所以对蟑螂的生理生化研究不仅可以帮助解析昆虫的生理代谢机制,更有助于研发新的害虫防治药物,从而有利于人类健康。
保幼激素在昆虫生命周期中起重要作用,以保幼激素合成通路中某一关键反应为突破点寻找药物靶标抑制保幼激素的合成,或者将保幼激素类似物作为农药,可以使昆虫发生代谢紊乱,例如保幼激素类
似物烯虫酯和吡丙醚可以使幼虫不能顺利完成化蛹及羽化,从而有效控制虫害,具有针对性强,对人危害低,绿色环保等特点。CiC作为乙酰辅酶A跨膜运输载体,不仅影响保幼激素的合成,更是参与到昆虫三大营养物质代谢和能量代谢,因此以CiC为切入点靶向设计新型杀虫剂,将比仅仅阻碍保幼激素合成对害虫有更好的防治效果。需要注意的是柠檬酸转运载体可能包括多种可以转运乙酰辅酶A的蛋白,因此需要更加深入和广泛地对CiC展开研究,我们才能更加全面地了解和发掘它在害虫防治上的巨大潜质。
NOTES
*通讯作者。