1. 引言
在自然界中,植物经常会受到各种病原物(如,病原真菌、细菌和病毒)的侵害。虽然植物不像动物具有特定的免疫系统来抵抗病原物的侵害,但植物在长期的进化中形成了多种防御体系来抵制病原物的侵袭 [1] [2] [3] [4] [5] 。THI2.1基因作为植物防御体系中的重要基因,一直受到人们的广泛研究。
THI2.1基因属于植物防御系统中病原相关蛋白基因家族中PR-13 (硫菫蛋白家族),其编码的硫菫蛋白在植物防御系统中扮演着重要的作用,当植物受到病原物感染时,THI2.1基因会大量的诱导表达并产生大量的硫菫蛋白来提升植物的抗病性。Epple, P等人的研究发现THI2.1基因对F. oxysporum f. sp. matthiolae病原物有着明显的抗性 [6] 。而chan等人通过将拟南芥的THI2.1基因转入易感病的番茄中,发现转入拟南芥THI2.1基因的番茄植株抗病性明显增强 [7] 。
GUS染色是生物学上常用的一种实验方法。利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织,甚至单个细胞内的表达情况 [8] [9] [10] [11] [12] 。目前将GUS基因作为显色基因来研究目的基因的表达情况得到了广泛的应用。本研究对拟南芥THI2.1基因启动子与带GUS标记基因的载体进行重组构建,并将重组载体转入拟南芥,为后续研究该基因的表达模式提供材料。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0,大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α,根癌农杆菌(Agro bacterium tumefactions) GV3101,载体pCAMBIA1301等都由作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组保存。
2.2. 植株培养条件
将拟南芥种子置于消毒液(20% bleach + 0.1% Triton100)中浸泡10~15 min,于超净工作台上用无菌水冲洗4~5遍,适当密度的播撒在MS固体培养基上,置于黑暗处4℃春化3 d,转入光照培养室22℃长日照(16 h光照/8 h黑暗)培养。长至7 d时,将其转入营养土(东北黑土与蛭石的体积比为1:1)中,盖上透明塑料薄盖1~2 d。
2.3. 载体的构建
2.3.1. 引物的设计及THI2.1启动子片段克隆
在TAIR网上查询拟南芥THI2.1基因选取上游启动子区域序列,用在线软件Plantcare对其进行启动子元件分析。利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计1对扩增引物THI-F/THI-R,在引物5’端分别加上PstⅠ和NcoⅠ酶切位点,扩增引物序列为:
THI-F:TGCACTGCAGCCCCTTTCTTTGACTA
THI-R: GTACCCATGGCTACTTGAACTTGTGCC
根据预测退火温度,选取56℃、58℃、60℃进行PCR扩增,确定引物最适温度为58℃。用SDS法提取拟南芥总DNA,以此为模板,用引物THI-F/THI-R进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段并纯化。
2.3.2. 重组载体的构建
对目的片段和pCAMBIA1301载体用PstⅠ和NcoⅠ限制性内切酶在37℃下过夜双酶切,将得到的目的片段和目的载体进行回收。用T4连接酶将THI2.1基因启动子连接至pCAMBIA1301载体的预期位点。通过热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α“见图1”,挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定,结果正确的送上海铂尚公司测序。
2.4. 重组载体的遗传转化
挑选测序正确的重组质粒,通过电击法转化到根癌农杆菌GV3101中,将转化液置于含有卡那霉素(50 mg/L)、庆大霉素(100 mg/L)、利福平(50 mg/L)的YEB固体培养基上28℃黑暗过夜培养,再挑取阳性菌进行扩大培养。采用浸花法转化拟南芥Col-0野生型。收获T0代种子播种于含有潮霉素(25 mg/L)的MS固体培养基上,长日照培养2周后将抗性植株移栽至营养土(东北黑土与蛭石的体积比为1:1)中正常生长。
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Figure1. Flow chart of pTHI2.1::GUS recombinant vector
图1. pTHI2.1::GUS重组载体构建流程图
3. 结果与分析
3.1. THI2.1启动子的克隆
利用Plantcare对THI2.1基因上游约1600 bp启动子序列进行分析,其中包含了大量核心启动子元件TATA-box、CAAT-box,以及部分与生物胁迫相关的顺式调控原件。以拟南芥基因组DNA为模板,通过引物THI-F/THI-R扩增出一段大小为约1800 bp的目的片段“见图2”,与预期大小相符。
3.2. pTHI2.1::GUS重组载体的构建
用T4连接酶将酶切后的目的片段连接到带有报告基因GUS的pCAMBIA1301载体上,通过热激法将pTHI2.1::GUS重组载体转化至大肠杆菌DH5α。为了验证载体的正确性,挑选阳性菌进行菌落PCR检测“见图3”,并对PCR结果正确的进行PstⅠ和NcoⅠ双酶切“见图4”。结果显示:目的片段与预期结果相符,表明pTHI2.1::GUS重组载体构建成功。检测正确的阳性菌送测序,测序结果经比对得出:目的片段大小正确,无移码突变现象,连接处与预期位置相符。
3.3. pTHI2.1::GUS重组载体的遗传转化
将成功转入农杆菌的重组载体,通过浸花法转化拟南芥Col-0野生型。收获T0代种子播种于含有潮霉素(25 mg/L)的MS固体培养基上,因潮霉素对拟南芥幼苗具有抑制作用,长日照培养2周后我们可观察到:成功转入重组载体的拟南芥幼苗能正常生长并长出真叶,转化失败的拟南芥幼苗无法正常长出真叶“见图5(a)”;而未进行转化的拟南芥Col-0野生型在含潮霉素的MS固体培养基上也无法正常长出真叶“见图5(a)”。
M为Marker(5K)Line 1为未加DNA模板的对照组Line 2-4为THI2.1启动子片段
Figure 2. PCR result of THI2.1 promoter
图2. THI2.1基因启动子PCR扩增结果
M为Marker(5K)Line 1-6为菌落PCR
Figure 3. PCR result of recombinant colonies
图3. 菌落PCR结果
M为Marker(15K) Line1-4为重组载体双酶切 Line 5为未酶切载体
Figure 4. Restriction enzyme digestion of pTHI2.1::GUS recombinant vector
图4. pTHI2.1::GUS重组载体的双酶切
(a) (b)(a) 箭头所指为转基因阳性植株 (b) 为未转基因野生型植株
Figure 5. The phenotype of transgenic plants on MS
图5. 转基因植株在培养基上表型
4. 讨论
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容 [13] 。启动子作为基因工程中表达载体的一个重要组成部分,它的选择与应用决定了目的基因在时间和空间上的表达的不同。
本研究所选择表达载体为pCAMBIA1301,此载体为常用载体,上面有较多较为常用的限制性内切酶以及筛选基因,更重要的是带有GUS报告基因。GUS染色是生物学上常用的一种实验方法,利用该方法可观察到外源基因在特定的器官和组织中的表达情况,GUS基因作为显色基因来研究目的基因的表达情况得到了广泛的应用。
在自然界中,植物经常会受到各种病原物(如,病原真菌、细菌和病毒)的侵害。虽然植物并不像动物具有特定的免疫系统来抵抗病原物的侵害,但植物在长期的进化中形成了多种防御体系来抵制病原物的侵袭 [1] [2] [3] [4] [5] 。THI2.1基因作为植物防御体系中的重要基因,本研究已成功构建THI2.1基因启动子与GUS重组载体,并通过浸花法转化至拟南芥野生型内得到转基因植株,下一步通过GUS染色,研究THI2.1基因在拟南芥中表达模式。
5. 结论
本研究成功构建了THI2.1基因启动子与GUS重组载体,为进一步研究THI2.1基因在植物体内的表达打下基础。
基金项目
国家级大学生研究性学习和创新性实验计划项目(G)SCX1604。
*并列第一作者。
#通讯作者。