1. 引言
咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma, CVA)是支气管哮喘的一种特殊类型,以慢性持续性干咳为主要临床表现。目前的研究表明CVA是典型哮喘的前体阶段,大约1/3-1/2CVA患者最终会发展为典型哮喘,严重危害人们的健康 [1] [2] [3] 。CVA的发病机制及病理生理表现与典型哮喘相似,均为多种炎性细胞和炎性介质参与的慢性呼吸道炎症性疾病 [4] 。百部–紫菀药对源自《医学心语》中方剂止嗽散,临床常用其加减方治疗咳嗽变异性哮喘,具有非常良好的疗效 [5] [6] 。止嗽散原方由百部、紫菀、陈皮等七味药物组成,其中百部–紫菀为其核心药对,属相须相使的协同配伍,体现着该方药效的核心作用。现代研究表明除了Th1/Th2细胞因子比例和功能失衡在哮喘发病机制中具有重要意义,Th17/Treg细胞因子的免疫失衡也是哮喘发病的重要机制之一 [7] 。本研究通过观察不同配伍比例百部–紫菀对CVA大鼠Th1/Th2及Th17/Treg细胞因子平衡的影响,探讨药对的平喘作用机理并探索配伍比例对药对的药效作用影响。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
SPF级雄性SD大鼠70只,体重200~260 g,购自湖北省实验动物研究中心(SCXK(鄂)2008-0005)。
2.2. 试剂与药物
百部,紫菀均购自于九江市开心人大药房,经九江学院高春华教授分别鉴定为对叶百部Stemona tuberosa Lour.,紫菀Aster tataricus L.f.。两味药材粉碎后分别按比例(1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 2:1)经过蒸馏水浸泡0.5 h后,煮沸提取,第一次提取1 h,第二次提取0.5 h,合并两次的提取液,提取液水浴浓缩至原生药量含量为3.6 g/ml。氢氧化铝为天津市科密欧化学试剂有限公司产品,以去离子水制成10%佐剂;卵蛋白(OVA)为美国Sigma公司产品,用去离子水配成1%浓度的使用液,溶入10%佐剂,制成浓度为1 mg/mL的溶液。细胞因子IL-4,INF-γ,IL-17,IL-10检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
2.3. CVA大鼠模型制备
健康SD大鼠经过3天适应后,以新配制的卵蛋白皮下注射,分别在两后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取10处,每处皮下注射0.05 mL,同时腹腔注射0.5 mL,合计1 mL,1周后重复1次,加强致敏效果。造模大鼠第15天置于4 L的玻璃罩内,以400 mmHg的超声雾化恒压喷入1%的卵蛋白溶液20 min激发大鼠哮喘,以大鼠腹肌出现明显收缩,并出现呼吸加深、加快等呼吸道痉挛症状,提示造模成功 [8] 。
2.4. 实验分组及动物干预方法
随机分为7组,分别为正常对照组,模型组,百部组,紫菀组,百部–紫菀(1:1)组,百部–紫菀(1:2)组,百部–紫菀(2:1)组,每组10只。百部组,紫菀组给药浓度为18 g生药/kg(相当于成人临床用量20倍),百部–紫菀药对各组给药浓度为36 g生药/kg (相当于成人临床用量20倍),每天一次;正常对照组、模型对照组以蒸馏水灌胃,每天一次。
2.5. 实验样本获取与处理
大鼠造模成功后,各实验组大鼠按实验剂量给药,实验第14天处死大鼠,剪开颈部皮肤,于气管正中处剪开小口,插入气管套管,以磷酸盐缓冲溶液行支气管肺泡灌洗,来回冲洗3次,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。涡旋混合混匀BALF,取50 μl加入等量的白细胞计数液,以细胞计数板计数炎性细胞。剩余灌洗液冷冻离心,3000 r/min离心10 min,取上清液,−80℃冰箱低温保存。
2.6. 动物状况观察
观察实验期间各组大鼠的呼吸频率、精神、饮食、活动、毛发、大小便等一般情况。
2.7. 细胞因子IL-4,INF-γ,IL-17,IL-10水平的检测
采用酶联免疫吸附法进行测定相关细胞因子水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。
2.8. 统计学分析
采用SPSS19.0统计软件进行分析,数据以均数 ± 标准偏差(
± SD)表示,组间比较方差齐性者用LSD检验、方差不齐性者用Dunnett’s检验,以p < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 大鼠一般情况
正常组大鼠反应正常,体重均有所增长(平均增重约15%),其他未见异常情况,模型组大鼠经抗原激发后出现躁动不安,打喷嚏,呼吸急促,饮水量增多,食量减少,反应迟钝,活动明显减少,毛色发黄并且掉毛,体重减轻(平均减重约10%)。百部组大鼠症状较模型组较好,活动、反应、饮食与正常组相仿,体重有所增长;而紫菀组大鼠仍具有部分模型组大鼠症状,活动较少,呼吸急促,体重减轻。百部–紫菀药对各组大鼠的上述症状明显好于模型组及紫菀组,活动、反应、饮食与正常组几乎无差异,体重有所增长(平均增重约10%)。
3.2. BALF中炎性细胞计数
各实验组大鼠炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数见表1。模型对照组大鼠BALF中炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数较正常对照组明显升高,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);百部组,紫菀组,百部–紫菀(1:1)、百部–紫菀(1:2),百部–紫菀(2:1)组大鼠BALF中炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数均较模型对照组明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);百部–紫菀药对各给药组间差异并不具有统计学意义(p > 0.05),但各药对组与单味药组相比炎性细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数均显著降低,差异均具有统计学意义(p < 0.05)。
3.3. BALF中细胞因子INF-γ,IL-4,IL-17,IL-10水平
各实验组大鼠BALF中细胞因子INF-γ,IL-4,IL-17,IL-10水平见表2。与空白对照组相比,模型对照组大鼠BALF中INF-γ,IL-10水平明显降低,IL-4,IL-17水平明显升高,INF-γ/IL-4比值明显降低,
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. The number of inflammatory cells, eosinophil, lymphocytes and neutrophil (×106/L, ± s, n = 10)
表1. 各实验组大鼠炎性细胞总数和嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数(×106/L,
± s, n = 10)
注:与空白对照组比较 a p < 0.05;与模型组比较b p < 0.05;与百部组比较c p < 0.05;与紫菀组比较d p < 0.05。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. The level of INF-γ, IL-4, IL-17, IL-10 and INF-γ/IL-4, IL-17/IL-10 in the rats BALF of experimental groups (pg/ml, ± s, n = 10)
表2. 各实验组大鼠BALF中INF-γ,IL-4,IL-17,IL-10及INF-γ/IL-4,IL-17/IL-10水平(pg∙ml−1,
± s, n = 10)
注:与空白对照组比较a p < 0.05;与模型组比较b p < 0.05;与百部组比较c p < 0.05;与紫菀组比较d p < 0.05;百部–紫菀药对组间比较(1:1与1:2) e p < 0.05,(1:1与2:1) f p < 0.05。
IL-17/IL-10比值明显升高,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);与模型组比较,各组大鼠BALF中INF-γ,IL-10水平明显升高,IL-4,IL-17水平明显降低,INF-γ/IL-4比值明显升高,IL-17/IL-10比值明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05);各药对组与单味药组相比,INF-γ/IL-4比值明显升高,IL-17/IL-10比值明显降低,相比较差异均具有统计学意义(p < 0.05),说明配伍增强了药效作用;百部-紫菀药对各给药组间INF-γ/IL-4差异并不具有统计学意义(p > 0.05),配伍1:1组药效作用最强,但给药组间IL-17/IL-10差异具有统计学意义(p < 0.05),配伍1:1组药效作用最强,说明配伍比例对于Th17/Treg细胞因子平衡具有一定的影响。
4. 讨论
哮喘是由多种炎性细胞、细胞因子和炎性介质共同参与的气道慢性非特异性炎性疾病,其关键的效应细胞是嗜酸性粒细胞和Th细胞 [9] 。目前的研究表明,Th1/Th2细胞因子的失衡是哮喘发病的重要机制 [10] [11] ,纠正Th1/Th2免疫失衡是治疗哮喘的重要途径;但目前也有较多研究发现哮喘的发病机制已不能单纯用Th1/Th2平衡理论来解释,Th17/Treg细胞因子的失衡在哮喘的发病过程中同样存在重要作用 [12] [13] 。IL-4是Th2型特征性细胞因子,可诱导Th2细胞分化,产生IgE,参与哮喘变态反应炎症的发生发展;IFN-γ为Th1型细胞的特征性细胞因子,可抑制Th2型细胞因子的产生,诱导Thl细胞分化,阻断1gE的合成,并且可有效地活化单核巨噬细胞,促进其杀伤力 [14] ;IL-17是Th17型特征性细胞因子,可诱导上皮细胞、内皮细胞等分泌IL-6、IL-8,增强IL-1及肿瘤坏死因子的功能,在炎症的发生发展过程中起促进作用 [15] ,且与气道高反应程度呈正相关关系;IL-10是Treg型特征细胞因子,可通过抑制活化中性粒细胞和嗜酸性粒细胞产生促炎因子和趋化因子如IL-1、IL-6、IL-8等表达,改善气道炎症反应 [16] 。
百部–紫菀药对是止嗽散复方的核心配伍,而复方配伍比例对于复方药效作用具有重要的影响 [17] [18] 。为了阐明药对百部–紫菀的平喘机制,本研究通过观察百部、紫菀单味药及不同配伍比例百部–紫菀对CVA大鼠Th1/Th2及Th17/Treg细胞因子平衡的影响,探讨药对的平喘作用机理并探索配伍及配比对药对的药效作用影响,并为止嗽散复方的平喘机理研究奠定基础。研究结果表明模型组大鼠可见明显的Thl/Th2及Th17/Treg平衡失调,同时嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞水平明显升高,统计学显示具有显著性差异;药对百部–紫菀给药后,大鼠Thl/Th2及Th17/Treg水平失衡均得到部分纠正,同时嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞水平明显降低,统计学显示具有显著性差异。实验结果同时显示药对的药效作用明显强于单味药物,表明配伍确实增强了药物的药效作用,而配伍比例的差异对药对的药效作用同样具有一定程度的影响,配伍1:1的药效作用是相对较强的,虽然对Thl/Th2水平的影响不具有显著性差异,但对Th17/Treg水平具有显著性差异,提示其平喘机制与纠正Thl/Th2与Th17/Treg细胞平衡,减轻炎性细胞浸润有关,而对Th17/Treg细胞平衡的影响值得进一步探讨。
基金项目
国家自然科学基金项目(81560642);江西省自然科学基金项目(20142BAB205081)。