鲑鱼降钙素PLGA微球缓释载体

Salmon Calcitonin-Loaded PLGA Microspheres as a Sustained-Release Vehicle

摘要: 本文制备六种不同分子量和末端基团的载鲑鱼降钙素PLGA微球(SCT-PLGA MS)，优选合适微球用于废用性骨质疏松症在骨折损伤部位缓释药物。载药微球平均粒径均为120 μm，形态圆整；包封率均高于60%，载药量约为0.5%；差示扫描量热(DSC)测试结果表明SCT包载在于PLGA微球中，并以无定形态存在；体外释放结果表明分子量为20 kDa的-COOH末端载药微球(SCT-PLGA-20 COOH MS) 40 天累积释放百分率达79%以上，具有良好的缓释作用；体外降解中SCT-PLGA-20 COOH MS pH值随时间延长下降速率高于其他微球。因此，本研究中SCT-PLGA-20 COOH MS有望用于治疗废用性骨质疏松症。

Abstract: In this study, to optimize appropriate poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) microspheres (PLGA MS) to release SCT in the treatment of disuse osteoporosis, six kinds of SCT-PLGA MS with different mo-lecular weight and terminal groups were prepared. SCT-PLGA MS had an average particle size of about 120 μm, an encapsulation efficiency of 60%, and a drug loading of 0.5%. The result of differential scanning calorimetry (DSC) evidenced that SCT had been entrapped as an amorphous form in MS matrix. For SCT-PLGA-20 COOH MS, the cumulative release was above 79% at 40 d. PH value of SCT-PLGA-20 COOH MS decreased more rapidly than that of MS with -CH3 in the degradation. In conclusion, SCT-PLGA-20 COOH MS is promising in the treatment of disuse osteoporosis.

1. 引言

老年患者尤其是绝经后妇女易出现原发性骨质疏松症。其主要表现为骨量减少，致使骨脆性增加，易发生骨折，导致其转化为废用性骨质疏松症。鲑鱼降钙素(Salmon calcitonin, SCT)可有效调节血钙水平和骨代谢，减少骨质流失 [1] 。但肌肉注射或静脉注射SCT的临床效果不佳，为提高SCT 在废用性骨质疏松症的治疗效果，可以通过缓释载体递送药物到骨折损伤处。聚乳酸聚羟基乙酸(Poly(D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 生物相容性良好，在体内最终转化成二氧化碳和水排出体外，具有骨传导性和骨诱导性，并可制成长效缓释微球(Microsphere, MS)，提高多肽、疫苗、激素等生物大分子药物的生物利用率 [2] 。PLGA的分子量以及末端官能团等理化性质均可显著影响MS中的药物释放和降解行为 [3] 。因此，选择合适分子量和末端基团的PLGA十分重要。

本研究通过复乳法制备不同分子量和不同末端SCT-PLGA MS，考察PLGA理化性质对SCT载药量、体外释放和体外降解的影响，优选PLGA载药微球用于治疗废用性骨质疏松症。

2. 方法

2.1. 材料

PLGA (LA:GA = 50:50)，分子量分别为20 kDa、40 kDa和60 kDa，特异性粘度分别为0.28 dl/g、0.37 dl/g和0.45 dl/g，末端基团为羧基(-COOH)和烷基(-CH₃)，购自山东医疗器械研究所；SCT购自上海苏豪逸明制药有限公司；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA) 购自Sigma-Aldrich公司；微量BCA试剂盒(Micro BCA)购自赛默飞世尔科技公司。

2.2. SCT-PLGA MS的制备

称取0.3 g不同分子量和不同末端基团的PLGA (20 kDa-COOH、40 kDa-COOH、60 kDa-COOH、20 kDa-CH₃、40 kDa-CH₃和60 kDa-CH₃)，加3 mL 二氯甲烷溶解，加入0.60 mL 4 mg/mL SCT溶液，超声3 min (输出功率150 W，工作2 s，间歇2 s)，形成W/O型初乳，立即将其注射到75 mL 0.06% (w/v) PVA溶液中，形成W/O/W型复乳。机械搅拌5 h使二氯甲烷完全挥发，静置，去离子水洗涤沉淀三次，冻干后4℃保存，得终产物SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-40 COOH MS、SCT-PLGA-60 COOH MS、SCT-PLGA-20 CH₃ MS、SCT-PLGA-40 CH₃ MS和SCT-PLGA-60 CH₃ MS。对照组加入与SCT溶液等体积的蒸馏水得未载药PLGA微球(blank-PLGA MS)。

2.3. SCT载药量和包封率

2.3.1. 标准曲线

按照Micro BCA试剂盒说明制备标准曲线。配制2 mg/mL的SCT溶液，精密量取50 μL，加入DDW稀释至0.5 mL，制得浓度为200 μg/mL贮备液。依次稀释，得浓度分别为40、20、10、5、2.5、1和0.5 μg/mL的SCT标准液，DDW作为空白对照。

以25:24:1(v/v/v)混合溶液A、B和C，配制Micro BCA工作液。吸取150 μL标准液，加入150 μL工作液，37℃温育2 h，量取200 μL，酶标仪测定562 nm处吸光值，以吸光值(A)对SCT浓度(C, μg/mL)线性回归，制备标准曲线。

2.3.2. SCT载药量和包封率

外水相法测定SCT-PLGA微球的载药量与包封率。制备SCT-PLGA MS，洗涤前，量取3 mL悬液，13,000 rpm离心3 min，取150 μL上清液，Micro BCA法测定562 nm处吸光值，由标准曲线计算SCT浓度。分别按下列公式计算载药量(Loading Capacity, LC)和包封率(Encapsulation Efficiency, EE)：

其中W、W₀和W₁分别表示PLGA质量、SCT总质量和上清液中SCT质量。

2.4. SCT-PLGA MS的表征

2.4.1. 粒径和跨距

将微球置于载玻片上，光学显微镜观察微球，计数300个，采用系统软件测量微球的平均粒径并计算D₁₀、D₅₀和D₉₀。D₁₀、D₅₀和D₉₀分别表示有10%、50%和90%的微球粒径小于该值所示的粒径。

2.4.2. 扫描电子显微镜 (SEM)

将少量SCT-PLGA MS固定于铝质圆台，喷金，SEM观察，加速电压20 kV。

2.4.3. 差示扫描量热 (DSC)

空铝坩埚为参比，另一铝坩埚中放入精密称重后的PLGA(20 COOH)、SCT、SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT与blank-PLGA-20 COOH MS物理混合物(5~6 mg)，扫描范围为0~200℃，升温速度为10℃/min，氮气流速为30 mL/min。

2.5. SCT-PLGA MS的体外释放

称取30 mg SCT-PLGA MS (20 COOH、40 COOH、60 COOH、20 CH₃、40 CH₃和60 CH₃)，置离心管中，加入2 mL 0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4，含0.06% (w/v) NaN₃)，37℃下以100 rpm恒温振荡，分别于1、3、7、10、15、20、23、26、30、33、36和40 d取样，并以2 mL PBS更换释放介质，继续温育。释放样品13,300 rpm离心3 min，量取上清液150 μL，Micro BCA法测定SCT浓度，计算累积释放百分率(%)。

2.6. SCT-PLGA MS的体外降解

称取30 mg SCT-PLGA MS (20 COOH、40 COOH、60 COOH、20 CH₃、40 CH₃和60 CH₃)，置离心管中，加入2 mL 0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4，含0.06% (w/v) NaN₃)，37℃下以100 rpm恒温振荡，分别于1、2、3、4、5、6和7周测定上清液的pH值。

3. 结果与讨论

3.1. SCT-PLGA MS的制备和表征

3.1.1. SCT-PLGA MS的制备

SCT的水溶液作为内水相在二氯甲烷溶剂中分散，超声形成W/O型初乳，在外水相PVA水溶液中分散后，机械搅拌，室温下有机溶剂二氯甲烷挥发，形成W/O/W型复乳，离心洗涤后冻干得到SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-40 COOH MS、SCT-PLGA-60 COOH MS、SCT-PLGA-20 CH3 MS、SCT-PLGA-40 CH3 MS和SCT-PLGA-60 CH3 MS。

3.1.2. SCT载药量和包封率

SCT标准曲线为A = 0.0118 C + 0.0834，r = 0.997。可见0.5~40 μg/mL浓度范围内吸光值(A)与SCT浓度(C, μg/mL)线性关系良好。

各组微球的载药量和包封率见表1，相同分子量的微球中，-COOH末端微球的包封率高于-CH₃末端微球，这是由于SCT的pI值为10.2，水环境下SCT结构中-NH₂质子化形成，PLGA的-COOH末端释放质子，以-COO⁻离子形式存在，可与以离子键连接，增加稳定性，提高包封率，而-CH₃末端微球与SCT无离子键连接，故包封率较低；PLGA分子量对微球包封率无显著影响。各组微球载药量约0.5%~0.6%。

3.1.3. 粒径

载药微球的粒径和分布见表2。微球粒径主要分布于71~226 μm，平均粒径约120 μm。文献研究表明，PLGA的黏度随分子量的增大而增加，高分子量PLGA乳化时易形成较大微滴，导致微球粒径较大 [4] ，但本实验中微球的分子量和末端基团对其粒径无显著影响，可能是由合成工艺的差异引起。

3.1.4. SEM

图1为SCT-PLGA MS的SEM照片，可见PLGA微球平均粒径大于100 μm，形态圆整，无明显黏连，外表面的孔洞结构是由制备过程中二氯甲烷的挥发所致。PLGA的分子量和末端基团不影响微球形态。

3.1.5. DSC

图2为SCT、blank-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-20 COOH MS以及PLGA原料20kDa-COOH和SCT物理混合物的DSC图谱，可见blank-PLGA-20 COOH MS和SCT-PLGA-20 COOH MS均出现尖锐的热焓松弛吸热峰，玻璃转化温度(Tg)分别为38.82℃和36.64℃，表明SCT与PLGA间的相互作用对聚合物的Tg值有较小影响；SCT图谱中110.58℃处出现宽吸热峰，PLGA和SCT物理混合物图谱中98.13℃处出现SCT的吸热峰，而SCT-PLGA-20 COOH MS中未见该吸热峰，表明SCT不是吸附于微球表面，而是包载于微球中，并以无定形态存在 [5] [6] 。

3.2. SCT-PLGA MS的体外释放

图3(A)为不同分子量和不同末端基团的SCT-PLGA MS在PBS (pH 7.4，含0.06% (w/v) NaN₃)中的药物释放曲线。SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-20 CH₃ MS、SCT-PLGA-40 COOH MS、SCT-PLGA-40 CH₃ MS、SCT-PLGA-60 COOH MS和SCT-PLGA-60 CH₃ MS的24 h 累积释放百分比分别为54.7%、16.0%、39.0%、31.9%、28.4%和19.3%，可见各组微球释药初期存在突释。分子量相同的PLGA微球，-COOH

Table 1. Encapsulation efficiency and loading capacity of SCT for SCT-PLGA MS. Indicated values were mean ± SD (n = 3)

表1. SCT-PLGA MS中SCT的包封率和载药量(n = 3)

Table 2. Size distribution of SCT-PLGA MS (n = 3)

表2. SCT-PLGA MS的粒径分布(n = 3)

^a10%的粒子其粒径小于该值；^b50%的粒子其粒径小于该值； ^c90%的粒子其粒径小于该值；注：结果以mean ± SD表示，n = 3。

Figure 1. SEM images of SCT-PLGA-20 COOH MS (a), SCT-PLGA-40 COOH MS (b), SCT-PLGA-60 COOH MS (c), SCT-PLGA-20 CH₃ MS (d), SCT-PLGA-40 CH₃ MS (e) and SCT-PLGA-60 CH₃ MS (f) observed

图1. SCT-PLGA-20 COOH MS (a)，SCT-PLGA-40 COOH MS (b)，SCT-PLGA-60 COOH MS (c)，SCT- PLGA-20 CH₃ MS (d)，SCT-PLGA-40 CH₃ MS (e)和SCT-PLGA-60 CH₃ MS (f)的扫描电镜照片

末端微球突释量高于-CH₃末端微球。这是由于突释药物主要来自微球表面SCT的解吸附和孔壁上SCT的溶解，-COOH末端微球的蛋白吸附率高于-CH₃末端微球，故突释量较大。-COOH末端微球中，释放

Figure 2. DSC thermograms of blank-PLGA-20 COOH MS (a), SCT-PLGA-20 COOH MS (b), SCT (c), and the mixture of PLGA and SCT (d)

图2. blank-PLGA-20 COOH S (a)，SCT-PLGA-20 COOH MS (b)，SCT (c)，及PLGA和SCT的混合物(d)的DSC图谱

Figure 3. (A) In vitro drug release profiles of SCT from different SCT-PLGA MS in PBS (pH 7.4) containing 0.06% (w/v) NaN₃ at 37˚C (n = 3); (B) pH of different SCT-PLGA MS as function of the degradation time (n = 3)

图3. (A) PBS缓冲液(pH 7.4，含0.06% (w/v) NaN₃)，37℃条件下，不同SCT-PLGA MS中SCT的体外释放曲线(n = 3)；(B) 不同时间各种SCT-PLGA MS溶液的pH值(n = 3)

速率随分子量的增大而减小，这是由于以下两个原因：低分子量PLGA黏度低，分子间作用力较弱，药物可较快从聚合物基质中扩散 [7] ；低分子量PLGA固化较快，形成较多孔隙，高孔隙度使药物扩散速率增大。-CH₃末端微球中，SCT-PLGA-20 CH₃ MS和SCT-PLGA-60 CH₃ MS释放较少，一方面由于吸附蛋白较少，另一方面可能是粒径分布较宽，大粒径微球较多，药物通过微球扩散的途径较长，导致累积释放百分率较低 [8] 。释放7 d后SCT主要从孔隙中扩散，释放速率降低；20 d后释放速率增加，这是由于PLGA逐步降解，形成孔隙，且降解生成的单体易溶于介质中，导致微球的快速溶蚀，SCT释放增多 [9] 。40 d时，SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-20 CH₃ MS、SCT-PLGA-40 COOH MS、SCT-PLGA-40 CH₃ MS、SCT-PLGA-60 COOH MS和SCT-PLGA-60 CH₃ MS的累积释放百分比分别为85.4%、44.3%、79.6%、63.0%、70.1%和59.0%，表明本研究制备的SCT-PLGA MS具有良好的缓释效果，其中-COOH末端微球较-CH₃末端微球释放更完全，SCT-PLGA-20 COOH MS 释放较理想。

3.3. SCT-PLGA MS的体外降解

PLGA微球的体外降解对SCT的体外释放有重要影响，体外降解越快释药速率越大，释药越多。PLGA降解产物为酸性较强的LA和GA。图3(B)为随降解时间延长不同分子量和不同末端基团的SCT-PLGA MS溶液pH的变化曲线。第3周时，SCT-PLGA-20 COOH MS、SCT-PLGA-20 CH₃ MS、SCT-PLGA-40 COOH MS、SCT-PLGA-40 CH₃ MS、SCT-PLGA-60 COOH MS和SCT-PLGA-60 CH₃ MS 溶液的pH值分别降至5.14、7.08、5.87、6.59、6.42和6.48，表明SCT-PLGA-20 COOH MS的降解速率最快。降解初期，聚合物发生水合作用，水性介质首先渗透到PLGA内部，使聚合物结构松散 [10] [11] 。-COOH末端微球亲水性强，摄取水分多，故PLGA骨架降解较快，而-CH₃末端微球亲水性弱，摄取水分少，PLGA骨架降解缓慢 [12] 。3周后，各组微球pH下降速率增大，这是由于聚合物开始水解，PLGA分子量逐渐减小，机械强度下降。随后PLGA的链状结构被破坏，更多的介质渗透进入微球，PLGA降解为水溶性单体，暴露更多羧基，导致pH值下降。如内部的降解产物未及时扩散到外部环境中，会引起微球内部pH局部降低，引发“自催化效应” [13] 。第7周时，各组pH值分别为3.22、3.33、3.04、3.26、3.43和3.57，较接近，表明PLGA MS已接近完全降解。

4. 结论

复乳法合成SCT-PLGA MS，平均粒径大于120 μm，形态圆整；SCT-PLGA-20 COOH MS虽突释显著，但累积释放量较高，体外降解迅速，有望用于治疗废用性骨质疏松症。

致谢

感谢指导过和帮助过本研究的老师和师长。