摘要: 植物液泡pH的碱性程度是蓝色花形成的一个重要因素。烟草NtPH1是矮牵牛蓝色花形成相关的控制液泡pH的PhPH1基因的直系同源基因。为了研究其功能,本研究利用植物CRISPR/Cas9系统构建NtPH1的双靶点敲除载体。通过对NtPH1基因片段的序列分析,选择两个PAM序列相距60 bp的位点作为靶序列,通过重叠PCR直接把两个靶位点分别拼接到AtU6-29和AtU6-26两个启动子驱动的sgRNA表达盒上,再利用Golden Gate克隆的方法把其连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体,重组克隆经菌落PCR筛选、质粒DNA酶切鉴定与测序,获得了NtPH1基因的双靶点敲除载体pCas9-PH1T1T2。这为进一步开展NtPH1基因的功能研究与蓝色花的基因工程应用奠定了基础。