单核苷酸多态性与原发性肝癌易感性及临床病理学的相关分析

Correlation Analysis of Single Nucleotide Polymorphism with Susceptibility and Clinicopathology of Primary Hepatic Carcinoma

摘要: 目的：探讨单核苷酸多态性(SNP)与本地区原发性肝癌(PHC)遗传易感性的关系，并探究SNP位点数目与肝癌患者临床病理学的相关性。方法：采用聚合酶链反应–限制性片段长度多态性技术检测234例肝癌患者和234例阴性对照的27个PHC相关SNP位点基因型和等位基因分布频率，并分析SNP位点与PHC遗传易感性、肝癌患者临床病理学和SNP位点数目的相关性。结果：1) miR-34b/c基因rs4938723位点CC基因型(调整OR = 1.736，95%CI：1.036~2.910，P = 0.036)、EGF基因rs4444903位点GG基因型(调整OR = 1.841，95%CI：1.103~3.071，P = 0.019)具有更高的PHC患病风险；KIF1B基因rs17401966位点GG基因型具有更低的PHC患病风险(调整OR = 0.540，95%CI：0.314~0.930，P = 0.026)；分层分析结果显示在男性(P = 0.039)和饮酒(P = 0.025)的人群中EGF基因rs4444903位点基因型GG相比AA + AG基因型PHC发病风险增加；在女性(P = 0.013)、年龄 < 60岁(P = 0.026)及不饮酒(P = 0.039)人群中KIF1B基因rs17401966位点GG基因型相比AA + AG基因型PHC发病风险降低。2) SNP位点数目与门静脉癌栓发生率增加有关(调整OR = 1.122，95%CI：1.005~1.251，P = 0.040)。结论：miR-34b/c基因rs4938723、EGF基因rs4444903、KIF1B基因rs17401966单核苷酸多态性与本地区PHC风险相关，SNP位点数目与肝癌患者临床病理学具有相关性。

Abstract: Objective: To investigate the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) and ge-netic susceptibility to primary hepatic carcinoma (PHC) in local population, and to explore the cor-relation between the number of SNPs and clinicopathology in patients with PHC. Methods: Poly-merase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to detect the genotype and allele distribution frequency of 27 PHC-associated SNPs in 234 hepatocellular car-cinoma patients and 234 negative controls, and to analyze the correlation between SNPs and genet-ic susceptibility to PHC, clinicopathology of hepatocellular carcinoma patients and the number of SNPs. Results: 1) The miR-34b/c gene loci rs4938723 CC genotype (adjusted OR = 1.736, 95%CI; 1.036~2.910, P = 0.036) and EGF gene loci rs4444903 GG genotype (adjusted OR = 1.841, 95%CI; 1.103~3.071, P = 0.019) had a higher risk of PHC. The KIF1B gene loci rs17401966 GG genotype (adjusted OR = 0.540, 95%CI; 0.314~0.930, P = 0.026) had lower risk of PHC. The stratification analysis showed that EGF rs4444903 GG genotype had a higher risk than AA + AG genotype in male (P = 0.039), and alcoholic population (P = 0.025), KIF1B rs17401966 GG genotype had a lower risk than AA + AG genotype in female (P = 0.013), age < 60 years (P = 0.026) and non-alcoholic popula-tion (P = 0.039). 2) More SNPs resulted in higher incidence of portal vein carcinoma thrombosis (adjusted OR = 1.122, 95%CI; 1.005~1.251, P = 0.040). Conclusion: Single nucleotide polymor-phisms in miR-34b/c gene rs4938723, EGF gene rs4444903, and KIF1B gene rs17401966 were asso-ciated with PHC risk in the region, and the number of SNPs correlated with clinicopathology in pa-tients with hepatocellular carcinoma.

1. 引言

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma, PHC)在世界范围内发病率和死亡率位居恶性肿瘤第六位和第四位。PHC主要由乙型肝炎病毒慢性感染所致，中国是乙肝大国，国家癌症中心数据显示，2015年中国肝癌发病率为17.35/10万，男性为26.15/10万，女性为8.54/10万 [1] ，肝癌发病率高居我国恶性肿瘤的第四位 [2] 。目前手术仍是PHC主流的治疗方案，但治愈率不高，生存周期短，死亡率高居我国恶性肿瘤第二位 [3] 。PHC的发生发展由环境–遗传共同决定的，特别是与个体间基因型的遗传多态性密切相关 [4] 。全基因组分析关联研究(Genome-wide association studies, GWAS)是目前研究变异基因位点最常使用的方法，GWAS能对PHC相关单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位点进行筛查和关联分析，确定了许多肝癌易感性、临床病理学相关的位点，但流行病学调查后发现PHC在群体中表现出易感个体和种族差异性 [5] [6] 。先前被筛选出的SNP位点是否在中国人群的PHC演变过程中也起着作用，又是否与本地区PCH遗传易感性相关尚不清楚，故选取27个PHC相关SNP位点对本地区人群进行研究。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

选自2014年1月至2021年1月在青岛大学附属烟台毓璜顶医院接受手术治疗的PHC患者234例与该院健康体检居民234例。病例纳入标准：具备PHC的诊断，诊断依据为《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》；临床检验、检查、病理及手术资料保存完整；既往无其他癌症诊断史。对照纳入标准：无PHC病史；既往无其他癌症的诊断史；与病例组来自同一地区。试验对象对试验知情同意，且通过医院医学伦理委员会批准。病史采集和标准化问卷收集研究对象年龄、性别，吸烟、饮酒情况，乙型病毒性肝炎、肝硬化病史，同时收集PHC患者相关临床病理学数据：肿瘤大小、有无远处转移、有无门静脉癌栓及有无卫星灶。

2.2. SNP位点的选择

利用TRANSFACR预测软件在NCBI dbSNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)筛选出与PHC相关的SNP位点，其选择标准为1) SNP位点的最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF) > 0.05；2) 低连锁不平衡(LD值：r² < 0.8；3)SNP位点处于启动子区、外显子区、5’UTR及3’UTR等重要功能区域；4) 检索2021年12月31日前发表的易感相关位点的文献，既往研究发现筛选位点与PHC有明确关联性。本研究最终筛选出27个SNP位点。

2.3. PCR-RFLP与基因分型

采用血液基因组提取试剂盒(北京博奥医学检验所有限公司)提取样本5ml静脉血，DNA片段需完整性好，无降解，无小片段RNA污染，置于−80℃冰箱保存备用。利用 Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(中国上海生工公司)，各SNP位点均需要一条延伸引物和两条PCR扩增引物。PCR扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 S，60℃退火30S，72℃延伸1 min，45个循环；72℃延伸5 min。将PCR产物使用限制性内切酶切断，消化程序：37℃ 40 min；85℃ 5 min。按照延伸反应扩增程序进行PCR产物的延伸，所得产物采用树脂板进行纯化。采用MassARRAY™质谱分析仪(美国Agena Bioscience公司)对产物进行质谱基因分析，检测数据使用Typer 4.0分析软件分析。

2.4. 统计学处理

使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。采用χ²检验对两组一般资料进行比较；拟合优度χ²检验计算SNP位点各基因型在对照组中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用Logistic回归模型分析两组间SNP位点与PHC遗传易感性及肝癌患者SNP数目与临床病理特征相关性，用比值比(Odds ratio, OR)及95%置信区间(Confidence interval, CI)来表示关联强度，对年龄、性别、吸烟及饮酒等影响因素进行调整，检验水准α = 0.05。

3. 结果

3.1. 研究对象一般资料

本次研究共纳入234例肝癌病例和234例阴性对照，结果显示：病例组和对照组的年龄(P = 0.136)、性别(P = 0.766)、吸烟情况(P = 0.501)、饮酒情况(P = 0.163)比例差异无统计学意义；而在病例组中肝炎病史(P < 0.001)、肝硬化病史(P < 0.001)分布差异具有统计学意义，即病例组中肝炎、肝硬化人群分布高于对照组(表1)。

Table 1. Comparison of general data of research objects

表1. 研究对象一般资料情况比较

3.2. 单核苷酸多态性与PHC

3.2.1. SNP检测结果

本次研究共纳入27个SNP位点进行二元Logistic 回归分析(表2)，有3个遗传变异(miR-34b/c基因rs4938723、EGF基因rs4444903、KIF1B基因rs17401966)具有统计学意义(表3)，显露出PHC易感性的相关。3个位点基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)，具有群体代表性和可比性。

Table 2. Analysis of 27 SNPs associated with PHC

表2. 27个SNP位点与PHC相关分析

Table 3. Analysis of rs4938723, rs4444903, rs17401966 and genetic susceptibility to PHC

表3. rs4938723、rs4444903、rs17401966位点与PHC遗传易感性分析

注：^*校正年龄、性别、吸烟及饮酒情况。

3.2.2. miR-34b/c基因rs4938723与PHC易感性相关分析

miR-34b/c基因rs4938723位点CC (调整OR = 1.736，95%CI：1.036~2.910，P = 0.036)基因型较TT、TC基因型具有更高的PHC患病风险。隐性模型中CC基因型(调整OR = 1.658，95%CI：1.054~2.609，P = 0.029)患病风险显著高于TT + TC组合基因型。

3.2.3. EGF基因rs4444903与PHC易感性相关分析

EGF基因rs4444903位点GG基因型较AA、AG基因型具有更高的PHC患病风险(调整OR = 1.841，95%CI：1.103~3.071，P = 0.019)。隐性模型中GG基因型(调整OR = 1.791，95%CI：1.118~2.870，P = 0.015)患病风险显著高于AG + AA组合基因型。

3.2.4. KIF1B基因rs17401966与PHC易感性相关分析

KIF1B基因rs17401966位点GG基因型较AA、AG基因型患PHC风险低(调整OR = 0.540，95%CI：0.314~0.930，P = 0.026)；隐性模型中GG基因型(调整OR = 0.537，95%CI：0.322~0.895，P = 0.017)患病风险低于AG + AA组合基因型。

3.2.5. 分层分析

本研究基于两组间一般资料比较结果，以性别、年龄、饮酒及吸烟情况进行分层分析后发现在男性(调整OR = 1.795，95% CI：1.029~3.130，P = 0.039)及饮酒(调整OR = 2.513，95% CI：1.124~5.616，P = 0.025)人群中EGF基因rs4444903位点处基因型为GG相比AA + AG基因型PHC发病风险明显增加；在女性(调整OR = 0.306，95% CI：0.120~0.782，P = 0.013)、年龄 < 60岁(调整OR = 0.403，95% CI：0.181~0.899，P = 0.026)及不饮酒(调整OR = 0.489，95% CI：0.248~0.964，P = 0.039)的人群中KIF1B基因rs17401966位点处基因型GG相比AA + AG基因型PHC发病风险明显下降(表4)。

Table 4. Results of rs4938723, rs4444903 and rs17401966 stratification analyses

表4. rs4938723、rs4444903、rs17401966位点分层分析结果

注：^*校正年龄、性别、吸烟及饮酒情况。

3.3. 突变SNP数目与临床病理学相关分析

在所筛选的27个SNP位点中，对234名PHC患者的SNP位点数目进行统计，采用多因素Logistic回归分析肝癌患者SNP位点数目与肿瘤大小、卫星灶、远处转移及门静脉癌栓临床病理情况(表4)，发现SNP位点数目与肿瘤大小(P = 0.373)、卫星灶(P = 0.242)、远处转移(P = 0.736)方面无统计学意义；在门静脉癌栓(调整OR = 1.122，95%CI：1.005~1.251，P = 0.040)方面具有统计学意义(表5)，即SNP数目是肝癌患者门静脉癌栓发生的危险因素，随着SNP位点数目每增多1个，优势增加12.2%，临床病理特征表现出更高的门静脉癌栓发生率。

Table 5. The number of SNPs and clinicopathology correlation analysis

表5. SNP数目与临床病理相关分析

注：^*校正年龄、性别、吸烟及饮酒情况。

4. 讨论

全世界每年肝癌新发约63万人，有超过一半发生在中国，极大地威胁着居民健康 [7] 。地域因素、生活方式等外部环境差异造成的患癌风险是不相同的，肿瘤的大小、分期分级，是否发生转移、有无门静脉癌栓等内部因素对患者预后影响也有差别，有研究表明TP53基因该位点的多态性可能会让其失去抑制肿瘤的功能，与之相反会获得一种推进肿瘤发生发展的新能力。杨等人研究发现TP53基因的变异会促进血管新生，肝脏肿瘤病灶转移发生率增高，肿瘤更具侵袭性 [8] 。如果提前对PHC高危人群进行筛查，或许能更早制定出针对性的诊疗方案来延长患者生存期。

SNP指的是单个核苷酸所引起的突变的DNA序列多态性。有研究证实单核苷酸多态性与PHC多个方面相关，如patatin样磷脂酶域3基因rs738409 SNP为病毒性、酒精性肝癌易感的危险因素 [9] ；脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶基因单核苷酸多态性与PHC的分期、门静脉侵犯、淋巴结转移存在关联 [10] 。但当前所确定的SNP位点可能会因为环境因素、遗传背景差异表现出不同的肿瘤易感性。

首先，我们发现234名病例中乙型病毒肝炎、肝硬化病史的人群分布明显高于234例阴性对照，这符合PHC病因学，即HBV感染是致使PCH发生的高危因素 [11] 。其次，我们发现本地区miR-34b/c基因rs4938723、EGF基因rs4444903、KIF1B基因rs17401966多态性与PHC易感性相关。miR-34b/c基因rs4938723的多态性是本地区PHC发生的危险因素，基因型为CC的个体较基因型为TT、TC的个体更易导致PHC的发生。MicroRNA影响着细胞增殖分化、组织和器官发育乃至肿瘤的发生发展，miR-34b/c基因通过转录形成细胞周期蛋白依赖性激酶和促凋亡蛋白进而增强对肿瘤发展的抑制；rs4938723位点恰好处于miR-34b/c基因的核心启动子区域，其多态性会改变启动子的转录活性，最终导致携带CC基因型的个体具有更高的患癌风险，Xu也发现亚洲群体在该位点携带等位基因C与肝癌易感高度相关，Mohammad Hashemi、Liu等人在后续的研究中也证实了这一点 [12] [13] [14] [15] 。EGF基因rs4444903 SNP早前就有多项研究发现与黑色素瘤、小细胞肺癌、大肠癌等多种恶性肿瘤相关，Jiang、Li等人发现该位点基因频率尽管在白种人、黄种人及黑种人中有所差异，但遗传多态性都与肝癌风险增加有显著关联 [16] [17] [18] [19] ，本研究证实了其多态性在本地区同样是PHC发生的危险因素之一，即GG基因型较GA、AA基因型更易导致PHC的发生，而且对于本地区年龄 < 60岁、女性及饮酒人群增加患癌风险更为明显。造成这一结局可能在于EGF基因参与肝组织的再生，该位点携带G等位基因会造成EGF的过度表达，使肝组织不受控制地增殖、发展为肝硬化最终癌变 [20] 。KIF1B基因rs17401966位点基因型为GG的人群较GA、AA基因型的人群患癌风险更低，我们同样发现这种保护作用在本地区年龄 < 60岁、男性及不饮酒的人群中更强。Luo、Wang等人统计分析了不同国家rs17401966多态性与PHC易感相关性，发现该位点的遗传多态性对于多数人种来说是一种保护因素，能够减少肝癌的易感，而这种患癌风险降低情况在中国人群中则更为明显，究其原因可能是KIF1B基因编码的蛋白参与细胞器、囊泡的运输，同时通过调节线粒体的运输，消耗癌细胞的能量，抑制癌细胞的生长 [21] [22] [23] 。

另一研究结果是发现随着SNP位点数目的增多，肝癌患者门静脉癌栓发生率更高。Hsieh等人早前就证实了SNP位点数目与PHC临床病理学之间的关系，他们发现VEGF-C基因出现更多遗传多态性位点会增加PHC的发生，其中rs7664413、rs3775194单核苷酸多态性同时存在则会导致更高的肝硬化发病频率 [24] 。Zhang等人发现当HOTAIR基因存在3个SNP的个体患肝癌的风险会增加8.46倍，而存在4个SNP的个体患肝癌的风险则将增加11.75倍 [25] 。基因多态性数目与临床病理学的相关性在其他肿瘤中也得到了体现，范等人发现BRCA1基因SNP阳性检出率与子宫肌层浸润深度有关，SNP阳性率更高的组别其肿瘤浸润深度更深 [26] 。樊等人证实了个体双基因位点突变较单基因位点突变更易造成甲状腺癌的多发病灶和淋巴结的转移，说明多位点遗传变异更具侵袭性 [27] 。Yuan发现随着遗传变异位点数目的增加，胰腺神经内分泌肿瘤的增殖指数和神经血管侵犯、器官受累概率也会增加 [28] 。张发现多位点突变的甲状腺癌患者较单位点突变患者具有更强的侧颈淋巴结及远处转移能力 [29] 。林的研究也证实在非小细胞肺癌中，单遗传位点突变患者的6个月生存率优于多遗传位点突变患者 [30] 。这种多遗传位点突变造成肿瘤生物信息行为更差的机制并没被完全被揭示，有的学者猜测可能是因为多基因位点合并突变导致肿瘤高负荷，使肿瘤的增长及扩散更易发生 [31] 。但目前该领域相关研究还是过少，SNP数目所造成临床病理学差异的具体机制尚不明确，还需要大量实验数据进行佐证。

综上所述，研究结果证实了3个SNP位点与本地区PHC易感性的关联，这或许能从遗传学角度为PHC发生机制提供额外数据，为筛选出PHC遗传标志物提供靶点。本研究虽未能直接揭示单核苷酸多态性位点数目造成临床病理学差异的机制，但提供了一个新思路，即通过SNP位点变异对PHC演变过程进行分析，以此预测不同基因型的肝癌临床病理学特征，帮助制定出临床治疗策略，改善患者治疗效果。

NOTES

^*通讯作者。