1. 引言
芦丁(Rutin)又称芸香苷,广泛存在于豆科植物槐花蕾和蓼科植物苦荞中 [1] [2] ,是自然界中常见的一种具有生物活性的黄酮成分。芦丁有抗菌,抗炎,抗氧化等多种活性,可以降低毛细血管异常通透性和脆性,临床主要用于高血压病的辅助治疗 [3] [4] 。另外,在食品工业中芦丁是很好的天然黄色素和抗氧化剂 [5] 。但芦丁的水溶性较差,限制其在体内的吸收及其他应用。目前通过芦丁-HPMC控释片、固体分散体、环糊精包合、纳米粒等技术来改善其水溶性并提高生物利用度 [6] [7] 。目前环糊精包合技术一般通过饱和水溶液法、溶液法、研磨法或超临界流体技术得到包合物 [8] [9] 。因芦丁在常用挥发性溶剂甲醇、乙醇、丙酮等中的溶解度较小,采用上述方法制备包合物的效率较低。本实验基于HP-β-CD在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶解度较大而在丙酮中溶解度较小的特点,采用反溶剂法制备环糊精包合物,并对其进行表征确定包合物的形成。另外考察了芦丁包合后水溶性及体外溶出的改善情况。
2. 仪器与材料
Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司),SHJ-A4水浴恒温磁力搅拌器(常州华奥仪器制造有限公司),LXJ-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂),Philips X-射线衍射仪(XRD,荷兰Philip公司);S4800扫描电镜(SEM,日本Hitachi公司)。
RU标准品(纯度为99.9%,上海源叶生物科技有限公司);RU原粉(纯度 ≥ 98%,阿拉丁试剂);HP-β-CD (阿拉丁试剂)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮(天津市天力化学试剂有限公司),分析纯;冰乙酸(天津市致远化学试剂有限公司),分析纯;甲醇、(山东禹王实业有限公司),色谱纯;水为去离子水。
3. 方法与结果
3.1. 反溶剂法制备芦丁-羟丙基-β-环糊精包合物
根据Tien An Nguyen等 [10] 的研究可知RU和HP-β-CD的最佳投料比为摩尔比1:1。将RU和HP-β-CD按比例溶解在DMF中,溶液室温下搅拌30 min,以体积比1:5将DMF溶液加入丙酮中,反应3 min,3500 r/min离心获得沉淀,并用丙酮洗涤3次,抽滤得包合物,50℃真空干燥12 h。
3.2. 芦丁含量测定
取适量RU-HP-β-CD溶于10 mL甲醇溶液中,利用高效液相色谱检测包合物中芦丁的含量 [11] 。Waters C18反相柱(250 × 4.6 mm,5 μm,中国),柱温为25℃,甲醇:0.5%冰醋酸的 = 60:40(v/v)作为流动相,流速为0.8 mL/min,进样量是5 μL,检测波长为354 nm [10] 。进样前所有样品经过0.22 μm滤膜处理。结果显示包合物中芦丁含量为26.5%。
3.3. 芦丁-羟丙基-β-环糊精表征
3.3.1. XRD
取适量芦丁、HP-β-CD、芦丁和HP-β-CD的物理混合物(以下简称物理混合物)及芦丁与HP-β-CD的包合物(以下简称包合物),使用X衍射仪对其晶型结构进行分析。检测条件为:衍射角范围4˚~50˚,扫描速率为4˚/min,电压40 kV,电流30 mA。图1中显示,芦丁有明显的晶体结构衍射峰,HP-β-CD为无定形态,两者的物理混合物中,环糊精在一定程度上减弱了芦丁的衍射峰,但在2θ = 26˚有芦丁的特征峰,而包合物中芦丁的衍射峰消失,说明芦丁已经被环糊精包合,以无定形态存在。XRD的检测结果与苏彩娟等人的研究(文章编号1673-2383(2011)01-0053-05)一致。
3.3.2. IR
分别称取适量干燥后的芦丁、HP-β-CD、物理混合物及包合物样品与KBr压片,放入红外光谱仪进行检测。薄片在400~4000 cm−1波数处检测,分辨率为4 cm−1。如图2所示,物理混合物在1208~1652 cm−1
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Figure 1. XRD results of Rutin (a); HP-β-CD (b); Physical mix (c); Inclusion complex (d)
图1. XRD图芦丁(a);羟丙基-β-环糊精(b);物理混合物(c);包合物(d)
之间完全显示出芦丁的特征峰,而包合物在这段区域峰的明显减少,这结果说明芦丁与HP-β-CD形成了包合物而不是简单的物理混合。红外检测结果与XRD相符。
3.3.3. SEM
为了进一步证实包合物的形成,将芦丁、HP-β-CD和包合物真空下镀金使用S4800型扫描电镜对其形貌进行观察分析。图3为三种样品的SEM图。图3a可以看出,芦丁呈规则棒状结构,HP-β-CD呈球形,由于主客分子的相互作用,包合物形态发生了明显的变化。HP-CD具有很好的水溶性特征,与其形成包合物后,芦丁的水溶性将会得到改善。
3.4. 溶解度的测定
取适量的芦丁、物理混合物和包合物置于10 mL的小瓶中,加入5 mL的蒸馏水,放入37.0 ± 0.5℃的水浴锅中,以100 r/min搅拌48 h。反应结束后从瓶中各取1 mL样品离心10 min取上清,离心速度为10,000 g。用甲醇稀释后取5 µL通过高效液相色谱进行检测。实验重复3次取平均值。图4中显示了芦丁、物理混合物和包合物在水中饱和溶解度的结果。芦丁、物理混合物和包合物的溶解度分别为0.12,
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Figure 2. Infrared spectrum of rutin (a); HP-β-CD (b); physical mix (c); inclusion complex (d)
图2. 芦丁(a);羟丙基-β-环糊精(b);物理混合物(c);包合物(d)的红外图谱
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Figure 3. SEM graphs of Rutin (a); HP-β-CD (b) and inclusion complex (c)
图3. 芦丁(a)、HP-β-CD (b)和包合物的SEM图谱
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Figure 4. Equilibrium solubility of rutin, physical mix, inclusion complex in water
图4. 芦丁、物理混合物和包合物在水中的饱和溶解度
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Figure 5. Dissolution profiles of rutin (a) and inclusion complex (b) in water
图5. 芦丁(a)和包合物(b)在水中的溶出速率
0.18,1.94 mg/mL。HP-β-CD对芦丁有一定的助溶作用,但包合物的溶解度明显高于芦丁原粉和物理混合物。由于HP-β-CD在水中有很好的水溶性,在芦丁与HP-β-CD形成包合物后,芦丁进入环糊精的空腔,使包合物表现出环糊精易溶于水的特性,改善了芦丁的水溶性。因此,可以通过反溶剂重结晶法获得环糊精包合物。
3.5. 体外溶出速率测定
为了研究包合物在体外释放的规律,本实验中分别取芦丁和包合物(含芦丁77.6 mg)置于200 mL水溶液中,并在37.0 ± 0.5℃和300 rpm的恒温振荡器中进行搅拌。在不同的时间间隔(0.083,0.16,0.25,0.33,0.5,1,1.5,2,4,6,8,12和24小时)中取1 mL样品进行离心,取上清利用高效液相色谱检测芦丁浓度,液相条件同3.2,计算芦丁在不同时间点的溶出速率。此实验重复3次获得平均值。
图5显示了芦丁原粉和包合物在不同时间点的溶出速率,可以看出,包合物的溶出速率远高于原粉,在水中溶出速率提高了约4倍,可释放80%左右,而由于芦丁的水溶性较差在24 h后只释放出20%。在Kouzou Miyake [12] 等人的研究中,RU-HP-β-CD的溶出速率是原药的2倍,而本实验中通过反溶剂法制备的羟丙基-β-环糊精包合物的溶出速率提高了4倍。
4. 讨论
环糊精包合物近年来在药物制备方面获得了广泛的应用。包合物与原药相比具有更好的亲水性和缓释效果,更利于人体吸收。另外包合物可以改善药物的稳定性,如对光热敏感、易分解的药物,且没有毒副作用 [13] 。在本研究中,改变传统获得包合物的方法,利用反溶剂重结晶法获得芦丁-羟丙基-β-环糊精包合物,并用XRD,SEM,红外对其进行表征,包合物表现出更多环糊精的特征形态,说明可以利用反溶剂法获得包合物。另外所得包合物很大程度上改善了芦丁的溶解度和体外溶出速率,有助于人体内更好的吸收,提高其生物利用度。
基金项目
国家重点研发计划课题(No.2017YFD060070601)。