1. 引言
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占90%以上,最新资料显示HCC高居中国肿瘤发病的第3、4位和肿瘤死因的第2、3位 [1] [2] 。对于原发性肝癌的治疗,最根本的方法是手术切除,但由于起病隐袭、侵袭性高、进展迅速和早期诊断困难,我国HCC患者确诊时多己为局部晚期或者发生远处转移,往往不适合或不能够单独采取外科手术、肝动脉栓塞化疗(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)或理化消融等局部治疗 [3] 。这类患者预后很差。
黄连素又称小檗碱,1959年Hano [4] 报道了其具有抗肿瘤活性。近年研究发现黄连素及其衍生物可选择性诱导人肝癌细胞死亡,但对人的正常肝细胞无细胞毒性,表明黄连素及其衍生物具有肝癌靶向细胞毒性,有可能成为有前途的多功能抗肝癌药物 [5] 。本文以体外细胞实验研究黄连素调节抑癌基因BTG2和细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1的表达来探讨其抗肝癌细胞株Hep-G2作用机制及可能影响的信号通路的研究,且该方面的研究及报道较少见,为其临床应用于肝癌的治疗提供理论基础,也为后期更为精确的用药提供理论支持。
2. 材料与方法
2.1. 药品和试剂
黄连素(盐酸小檗碱)购自成都艾特姆生物科技有限公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;PI染色试剂盒及AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒均购自Bio-Swamp公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,鼠抗BTG2和兔抗CyclinB1、CyclinD1抗体均购自Abcam公司;引物由上海Invitrogen生物制品公司合成;Trizol购自北京康为世纪生物科技有限公司,SYBR Green PCR试剂盒购自KAPA Biosystems公司,逆转录试剂盒购自TAKARA公司。
2.2. 细胞系与细胞培养
人肝癌细胞株Hep-G2由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)提供,用MEM Hyclone培养基、10%胎牛血清、青霉素-链霉素溶液配制成的完全培养基,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养,待细胞生长至对数生长期时备用。
2.3. CCK-8检测BBR对Hep-G2细胞增殖的抑制作用
取对数生长期的Hep-G2细胞,接种于三个96孔板中,100 ul/孔,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后,给予不同浓度的BBR (12.5,25,50,100,200 µmol/L)干预细胞,另设阴性对照组(只有细胞和培养基)和空白组(没有细胞只有培养基),每个浓度设五个复孔,每个96孔板边缘孔均加入PBS 100 ul,分别培养24 h、48 h、72 h后,吸出原液,用遇冷的PBS洗涤一遍,每孔加入用MEM培养基稀释的CCK-8 100 ul,置于细胞培养箱中孵育三小时。用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm处的吸光度值,然后根据公式计算细胞增殖抑制率。实验重复三次。细胞增殖抑制率(%) = [1 − (实验组OD值 − 空白组OD值)/(阴性对照组OD值 − 空白组OD值)] × 100%。经加权直线回归方程计算出黄连素抑制细胞增殖率为25%时的对应浓度值。
2.4. 流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡率
取对数生长期的细胞,制成3 × 105/ml的单细胞悬液,接种于三个6孔板中,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后,给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理,另设空白对照组,继续孵育24、48、72小时。孵育时间到后用遇冷的PBS洗涤两遍,胰酶消化,离心收集细胞,并重悬于200 ul的Binging Buffer中,再根据PI染色试剂盒和AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行细胞染色,最后用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡细胞分布情况。实验重复三次。
2.5. Western Blot检测BTG2和CyclinB1、CyclinD1的蛋白表达情况
取对数生长期的细胞,制成3 × 105/ml的单细胞悬液,接种于三个6孔板中,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后,给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理,另设空白对照组,继续孵育24、48、72小时。收集细胞后提取蛋白并根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定各组蛋白的含量,每组样品各取40 µg蛋白进行上样。根据10% SDS-PAGE凝胶试剂盒制成分离胶和5%的浓缩胶,进一步电泳、转膜,将凝胶上的蛋白转移至NC膜上。用5%的BSA室温下于摇床上封闭1小时,加入一抗(鼠抗BTG2和兔抗CyclinB1、CyclinD1,工作液的浓度分别为1:500、1:1000和1:1000),于4℃冰箱里孵育过夜,1 × TBST洗涤液洗膜后再加入相应的二抗((1:5000 HRP 标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG),室温下于摇床上孵育30 min,以β-actin作为内参。仍然用1 × TBST洗涤液洗膜后,用ECL化学发光法进行观察。实验重复三次。
2.6. RT-PCR检测BTG2和CyclinB1、CyclinD1 mRNA的表达
取对数生长期的细胞,制成3 × 105/ml的单细胞悬液,接种于三个6孔板中,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后,给予抑制率为25%的BBR用药浓度对细胞进行处理,另设空白对照组,继续孵育24、48、72小时。孵育时间到后收集各组细胞,提取蛋白后用Trizol提取总RNA,并测定RNA的质量,根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA,根据该试剂盒的说明书,反转录的条件是:20 uL反应体系,其反应程序是42℃,60 min;70℃,10 min;−20℃,hold。根据PCR试剂盒说明书及荧光定量PCR仪对cDNA进行扩增,反应体系20 uL:PreMix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 模板1 μL及ddH2O 8 μL,PCR扩增反应程序设置:94℃预变性1 min;94℃变性15 s,58℃退火20 s,72℃延伸20 s,循环40次;72终末延伸5 min;4℃保温。最后运用c-omparative2−△△CT 法分析各基因的相对表达。实验重复三次。所用引物序列见表1。
2.7. 统计学处理
应用SPSS 20.0软件进行实验数据的统计学分析,实验数据均以
表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,若方差不齐则采用Tamhane检验,以p < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. BBR对肝癌Hep-G2细胞增殖的影响:见表2
各组BBR作用于HepG-2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后,细胞生长出现明显抑制,且细胞生长抑制率随药物浓度的增加而升高。经加权直线回归方程计算出BBR作用于HepG-2细胞24 h的抑制率为25%的BBR用药浓度为30 µmol/L。
3.2. BBR对Hep-G2细胞凋亡的影响:见图1,表3
将浓度为30 µmol/L的BBR干预Hep-G2细胞24 h、48 h、72 h小时后,与对照组相比,实验组细胞凋亡率增加,具有明显的时间依耐性,差异具有显著性(P < 0.01)。
3.3. BBR对Hep-G2细胞BTG2 mRNA和CyclinB1、CyclinD1mRNA表达的影响:见图2
将浓度为30 µmol/L的BBR分别干预细胞24 h、48 h、72 h后,与对照组相比,BTG2 mRNA的相对表达量逐渐增加(P < 0.01),随着作用时间的延长增加更显著(P < 0.01)。而CyclinB1、CyclinD1mRNA的表达,与对照组相比,逐渐减低(P < 0.01)。
3.4. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的影响:见图3
与对照组相比,将浓度为30 µmol/L的BBR分别干预细胞24 h、48 h、72 h后,BTG2蛋白的表达逐渐增高(P < 0.01)。同时CyclinB1、CyclinD1蛋白的表达逐渐减弱(P < 0.01或P < 0.05)。
4. 讨论
黄连素,可从传统中药黄连、黄柏、三颗针等植物中提取,黄连素及其衍生物在治疗心血管疾病、抗肿瘤、免疫调节、精神疾病、骨质疏松等多方面具有一定的药理作用。近年研究显示黄连素可通过诱导ROS生成 [6] 、调节HIF-1α、抑癌因子p21WAFl/CIPl、细胞周期蛋白CyclinB1的表达 [7] [8] 、触发Caspase-3、Caspase-8和Caspase-7的活性 [9] 、抑制NF-κB的活性及其通路影响VEGF mRNA和蛋白的表达 [10] 、提高GRP78/HSPA5的表达 [11] 等多种途径影响肿瘤细胞的增殖、调控细胞周期、抑制侵袭及转移、调节自噬、增敏增效等方面发挥其抗肿瘤作用。
BTG2 (B-cell translocation gene-2)作为一种抗增殖基因,是早期瞬时反应基因之一,属于BTG/Tob抑癌基因家族成员之一。已有大量研究证实,BTG2在许多肿瘤中的表达下调,在多种肿瘤细胞的分化、
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Table 1. Real-time fluorescence quantitative PCR primers were used in this study
表1. 本研究使用的实时荧光定量PCR引物序列
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Table 2. Comparison of the growth inhibition rate of hepg2 cells with different concentrations of berberine at different time levels (%,)
表2. 不同浓度的BBR培养HepG2不同时间后细胞生长抑制率的比较(%,
)
注:BBR为黄连素;Hep-G2为人肝癌细胞株;每组每个时间点的样本量为3;a代表与空白对照组的比较P < 0.01;b代表与12.5 μmol/L的比较P < 0.01;c代表与25 μmol/L的比较P < 0.01;d与50 μmol/L的比较P < 0.01;e与100 μmol/L的比较P < 0.01。
注:左上象限为坏死细胞;左下象限为正常细胞;右上象限为凋亡中晚期细胞;右下象限为凋亡早期细胞。
Figure 1. The effects of BBR on apoptosis of Hep-G2 cells measured by flow cytometry
图1. 流氏细胞仪测BBR对Hep-G2细胞凋亡的影响
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Table 3. The comparison of the apoptosis rate of Hep-G2 cells with a certain concentrations of berberine at different time levels (%,)
表3. 一定浓度的BBR培养Hep-G2不同时间后细胞凋亡率的比较(%,
)
注:BBR为黄连素;Hep-G2为人肝癌细胞株;a代表与对照组相比P < 0.01;b代表实验组之间与24 h的比较P < 0.01;c代表实验组之间与48 h的比较P < 0.01。
注:*代表相对于对照组P < 0.01。
Figure 2. The effects of BBR on the expression of Hep-G2 cells in BTG2 and CyclinB1 and CyclinD1 mRNA
图2. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1mRNA表达的影响
注:A. Western Blotting检测BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达情况;B、C、D半定量分析BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达情况(*代表相对于对照组P < 0.01,#代表相对于对照组P < 0.05)。
Figure 3. The effects of BBR on the expression of Hep-G2 cells in BTG2 and CyclinB1 and CyclinD1 protein
图3. BBR对Hep-G2细胞BTG2和CyclinB1、CyclinD1蛋白表达的影响
增殖、DNA损伤修复以及凋亡中起重要作用 [12] [13] [14] [15] [16] ,且与肿瘤的大小、分级、转移、复发及预后不良都有一定关系 [17] 。多个实验研究表明上调BTG2的表达,可抑制乳腺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡 [18] [19] [20] [21] 。目前,也有学者证实BTG2在肝癌组织中不表达或者表达非常低,而相应的癌旁组织或正常肝细胞中表达则较高,提示BTG2的高表达对肝癌的发生、进展均具有抑制作用 [22] [23] 。本实验结果发现一定剂量的黄连素干预Hep-G2细胞后,BTG2蛋白及mRNA的表达都随着时间延长逐渐增强,差异具有统计学意义。
细胞周期蛋白Cyclin B1作为Cyclins家族的一员,活化并与CDKs即CDC2 (cell division cycle)形成复合物,促使细胞进行G2/M期转变。有多项研究表明,Cyclin B1的表达,在肿瘤细胞的增殖中起重要作用 [24] [25] 。有研究 [26] 发现人肝癌组织中CyclinB1 mRNA表达水平与临床分期、门静脉癌栓、术后复发、肿瘤直径和肿瘤低分化等成正相关。在本实验中当一定剂量的黄连素干预HepG-2细胞后,CyclinB1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强,具有明显时间依赖性,差异具有统计学意义。
Cyclin D1作为一种潜在的原癌基因蛋白,且是调控G1期的关键蛋白,并且在多种肿瘤中过表达。有研究表明下调Cyclin D1的表达,可使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡 [27] [28] 。目前,另有学者研究cyclin D1在丙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织中的表达较癌旁组织,以及基本正常肝脏组织明显增高,且与肝癌组织的病理学分级及患者的不良预后呈正相关,提示cyclin D1高表达的致癌作用 [29] 。在本实验中当一定浓度的黄连素干预HepG-2细胞后,CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均随着时间延长逐渐增强,具有明显的时间依耐性,差异具有统计学意义。
肿瘤发生的本质原因是癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。BTG2作为抗增殖蛋白基因,是细胞周期动力学的重要调节因子,与细胞周期的控制和细胞对DNA损伤反应有关。研究 [8] [28] 发现提高BTG2的表达可抑制CyclinD1蛋白的转录活性,降低CyclinD1蛋白表达,然后通过经视网膜母细胞瘤基因(Rb)途径使细胞阻滞在G1期,促使细胞凋亡。BTG2也可通非Rb途径阻止CyclinB1和Cdc2的结合,抑制Cdc2激酶活性,导致G2期的停滞,而诱导G2/M期的细胞周期阻滞及细胞凋亡。在该实验中我们发现随着一定剂量的黄连素作用时间的延长,细胞的凋亡率逐渐增多,且BTG2蛋白表达逐渐上升,同时CyclinB1、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达逐渐下调,引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡。
由此我们推断,黄连素具有抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。这与前期,我们实验组研究的48 h的半数抑制浓度IC50 = 41.18 μmol/L的黄连素调节肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的结果相一致。其机制之一可能是通过上调抑癌基因BTG2的表达,同时引起CyclinB1、Cyclin D1的表达下调。但是在该实验中黄连素对抗增殖基因BTG2的作用机制并不清楚,有待进一步研究,且BTG2抗肿瘤的作用与Cyclin B1、Cyclin D1的表达抑制是否有直接相关性,也需要进一步实验来证实。若将黄连素用于肝癌的临床治疗,是否具有临床疗效,还需要临床试验及进一步深入探讨。
基金项目
国家自然科学基金青年项目(81301631)。
湖北省卫计委青年人才项目(WJ2017H0036)。