1. 引言
牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)是毛茛科植物,其干燥根皮俗称牡丹皮,别名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮等,丹皮是一种传统中药,首载于《神农本草经》:主寒热,中风瘛疭、痉、惊痫邪气,除症坚瘀血留舍肠胃,安五脏,疗痈疮。丹皮酚(Paeonol)又称牡丹酚、芍药醇,系牡丹皮挥发油的主要成分。现代药理学研究表明,丹皮酚具有消炎 [1] 、抗乙型肝炎 [2] 、抗心肌损伤 [3] 、抗氧化 [4] 、抗螨虫 [5] 和降血糖 [6] 等作用。随着对丹皮酚药理研究范围的不断拓展,其提取和分离的工艺研究也在不断深入。
目前丹皮酚的提取方法有CO2超临界萃取法 [7] 、超声法 [8] 、微波法 [9] 、水蒸气蒸馏法 [10] 和乙醇渗漉法 [11] 等。对于CO2超临界萃取法、超声法和微波法,工业生产中提取设备费用昂贵;水蒸气蒸馏法容易产生大量工业废水;乙醇渗漉法提取速率慢,提取时间长。因此,采用溶剂提取时,如果能优化工艺,回收溶剂,减少废液排放,在提取工艺简单化同时,使生产成本大大降低,将更加符合实际生产需求。响应曲面法(Response surface methodology, RSM)将有助于对提取工艺进行优化。它是一种集数学、统计学于一体的试验设计方法,通过描绘评价指标(或响应值)对试验变量的响应面,采用多元二次方程来拟合变量和响应值之间的函数关系,最终找到试验变量的最佳组合及最优响应值 [12] [13] 。与往常用的均匀设计和正交设计相比,弥补了实验精度不够,建立的数学模型预测性较差的缺点,在中药有效成分提取中发挥着越来越重要的作用。
本研究拟采用乙醇溶剂法提取丹皮酚,先设计单因素实验,再采用Box-Behnken响应曲面法考察乙醇浓度(体积分数)、提取温度和提取时间三个因素对提取率的影响,从而优化丹皮酚的提取工艺,为实际生产提供参考数据与依据。
2. 材料
2.1. 材料
丹皮购自重庆市垫江县澄溪镇丹皮种植区,将丹皮烘干和粉碎待用。
2.2. 仪器
岛津LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器公司);UV-3150型紫外可见分光光度计(日本Jasco公司);AL-104电子分析天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司);德国Heidolph MR Hei-Tec磁力搅拌器(香港德祥科技有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);FFC-45D型粉碎机(临沂大华机械厂);DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。
2.3. 药品及试剂
丹皮酚(西南大学药学院药用资源化学研究所自制,HPLC纯度 > 99.0%);甲醇(色谱纯,成都市宜邦科析仪器有限公司);磷酸,95%乙醇(皆分析纯,成都市科龙化工试剂厂);纯水器(重庆前沿水处理设备有限公司)。
3. 方法
3.1. 丹皮酚含量的测定
3.1.1. HPLC条件 [14]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相甲醇−0.1%磷酸水溶液(45:55, V/V);流速0.5 mL·min−1;紫外检测波长274 nm;进样量10 μL。
3.1.2. 丹皮酚的提取率
按照2015版《中国药典》,牡丹皮药材含量测定项下操作,平行测3次。丹皮酚提取率(%) = 丹皮酚提取量(g)/药材中丹皮酚总量(g) × 100%。
3.2. 原料预处理
将丹皮在50℃恒温鼓风干燥箱内烘干,粉碎过60目筛后备用。丹皮颗粒大,丹皮酚的提取溶出度小;颗粒小,原料过滤分离慢,颗粒直径控制在1 mm左右。
3.3. 丹皮酚的提取与测定
称取丹皮样品50 g,置于配回流装置的圆底烧瓶中,加入不同浓度(体积分数)的乙醇溶液250 ml,在不同温度下磁力搅拌(1500 rpm)一定的时间,过滤后滤液定容,根据药典中的高效液相色谱法,以纯化的丹皮酚标准品作标准曲线,测定丹皮酚的提取率。实验先采用单因素实验考察料液比、乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率的影响。四组单因素实验具体方案如下:① 料液比10:1、20:1、30:1和40:1 (mL/g) (固定条件:乙醇浓度80%、提取温度50℃、提取时间2 h);② 乙醇浓度20%、40%、60%、80%和95% (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、提取温度50℃、提取时间2 h);③ 提取温度15℃、30℃、50℃、70℃和90℃ (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取时间2 h);④ 提取时间0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h (固定条件:料液比20:1 (mL/g)、乙醇浓度80%、提取温度50℃)。每组实验重复3次。
3.4. 数据分析方法
根据单因素实验结果,选取乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚提取率影响较大的因素,通过响应曲面法,利用Box-Behnken软件对提取条件进行回归设计和优化,每一变量的低、中、高水平分别为−1,0,1进行编码,实验因素和水平见编码见表1。
4. 结果与分析
4.1. 单因素实验
4.1.1. 料液比对丹皮酚提取率的影响
由图1可知,牡丹中丹皮酚的提取率随着料液比的增加先增大后趋稳定,当料液比大于30:1时,提取率略有降低。这可能与固液两相的扩散和吸附平衡有关,起初以扩散为主,溶质浓度增大,提取率增
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Table 1. Protocol of Box-Behnken central composite design
表1. Box-Behnken中心组合实验设计方案
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Figure1. Effect of solid/liquid ratio on paeonol extract yield
图1. 料液比对丹皮酚提取率的影响
加;然后随着溶剂增多,固相吸附能力增加,溶质在溶剂中的分配减少,提取率出现降低。
4.1.2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响
从图2得到,随着乙醇浓度的增加,丹皮酚的提取率先增加后降低。乙醇浓度增加,丹皮酚的溶解度增加,当达到80%时,丹皮酚提取率达到最高90%;当继续增加乙醇浓度时,其他脂溶性成分溶解度也开始增加,有可能影响了丹皮酚的提取效果。
4.1.3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响
从图3观察发现,随着提取温度的增加,丹皮酚的提取率增加,但当温度70℃~90℃,乙醇的挥发速度加快,溶剂有损失。在低于50℃时,提取率增加明显;当温度高于50℃时,提取率的增加明显减缓。
4.1.4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响
从图4观察可知,提取2 h时提取率最高,随着提取时间的延长,提取效果趋于稳定。这可能与溶质在溶剂中的饱和度有关,当溶质逐渐达到最大溶解时,丹皮酚提取率变化减小。
4.2. 丹皮酚提取响应曲面法实验
4.2.1. 丹皮酚提取率拟合回归模型的建立
按照实验设计(表2),采用design-expert软件进行多元回归拟合:以丹皮酚的提取率(Y)为响应值,各因子与响应值之间的回归方程为:Y = −1.11 + 0.04A + 0.01B + 0.07C + 5.89 × 10−5AB + 1.09 × 10−3AC + 4.3 × 10−4BC − 2.61 × 10−4A2 − 1.25 × 10-4B2 − 3.91 × 10−2C2 (R2 = 0.9905)。
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Table 2. Design and results of the three-variable/three-level response surface method
表2. 响应面法实验设计与结果
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Figure 2. Effect of ethanol concentration on paeonol extract yield
图2. 乙醇浓度对丹皮酚提取率的影响
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Figure 3. Effect of extract temperature on paeonol extract yield
图3. 提取温度对丹皮酚提取率的影响
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Figure 4. Effect of extract time on paeonol extract yield
图4. 提取时间对丹皮酚提取率的影响
4.2.2. 回归方程显著性分析
从表3可以看出,乙醇浓度、提取温度和时间对丹皮酚的提取率分别具有极显著(P < 0.01)。回归模型方程的决定系数R2 = 0.9905,变异系数1.46,失拟项不具有显著差异(P > 0.05),说明实验拟合度高,误差小,实验具有可靠性,能用于乙醇提取丹皮酚工艺的分析优化。
4.2.3. 响应曲面分析
响应面优化与预测:依据二维等高线和三维响应面,当设定Y最大时,丹皮酚最佳提取工艺。此时
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Table 3. Analysis of significant difference of the regression equation
表3. 回归方程显著性分析
注:*表明显著性差异(P < 0.05);**表明极显著性差异(P < 0.01)。
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Figure 5. 3D-response surface curves of different two factors including ethanol concentration, extract temperature and extract time on paeonol extract yields
图5. 乙醇浓度、提取温度、提取时间各两因素对丹皮酚提取率的三维响应面曲线
乙醇浓度77.5%,提取温度50℃,提取时间2 h,提取率92.3%。结果见图5。
5. 结论
目前丹皮酚由于具有显著的抗炎活性,在国内医药市场上已得到广泛应用,但是提高和优化丹皮酚的提取纯化工艺,对丹皮酚原料市场具有重要意义。本实验通过单因素和响应曲面实验,研究了丹皮中丹皮酚的提取工艺并进行了优化,得出用77.5%乙醇浓度、50℃提取温度、2 h提取时间和料液比30:1 (mL/g)时,丹皮酚的提取率达到92.3%,该提取工艺稳定可靠,能应用于工业化生产。
参考文献