1. 引言
诺丽(Morinda citrifolia Linn.)是茜草科巴戟天属的传统药用植物 [1] ,原产于南太平洋热带诸岛,分布在我国的台湾、海南和西沙群岛 [2] 。在美国夏威夷被认为是上天赐予的宝贵礼物,可用于各种疾病的治疗,尤其是预防和抗肿瘤、抗氧化和降血糖与降血压等 [3] 。诺丽富含芦丁rutin、黄酮醇flavonol glycoside、木脂素、香豆素,3-bisdemet hylpi等抗氧化活性物质,在医药工业具有较高的药用价值和潜在的应用前景 [4] [5] 。然而,国内对诺丽内生真菌抗氧化活性的研究较少。诺丽在中国因其生长条件的限制和种群分布的局限性,使得该物种种质资源并不丰富,甚至处于濒危灭绝边缘,故寻找新来源的抗氧化活性物质非常紧迫。植物内生真菌是寄生在植物的健康组织内无明显感染症状的共生真菌 [6] 。植物内生真菌(endophytic fungi)已被认为是一种新型的和有前景的天然活性化合物资源,广泛应用于农业,工业和医学领域 [6] 。
海南拥有适宜诺丽生长的热带沿海气候和土壤条件,对诺丽的开发研究具有地理优势且内生真菌的药用价值已成为国际热点。本文以诺丽(M. citrifolia)果和叶中分离得到的8株内生真菌为研究对象,采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP总还原能力分析其抗氧化活性,以期寻找一种新型天然抗氧化剂的潜在来源,并为诺丽内生真菌在医药健康领域的应用价值提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
对采自我国海南省不同市县的八成熟诺丽果和叶,用纯净水洗净,依次以2.6%次氯酸钠 + 75%酒精做6个梯度32组进行表面消毒:次氯酸钠溶液消毒的时间为60~300 s,乙醇溶液消毒的时间为30~180 s。然后用无菌水洗涤3次,用无菌滤纸吸干水分后,用灭菌过的手术刀将果和叶边缘部分去除,果内部或中心部分切分成1 cm × 1 cm大小的组织块,叶内部或中心部分切分成0.5 cm × 0.5 cm大小的组织块 [7] 。果块和叶块进行无菌检测:采用组织印迹法,将果块和叶块置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min,移去果块和叶块,25℃、黑暗条件下、恒温培养8~10天,无杂菌长出即说明消毒后的果块表面和叶块表面无菌;然后把果块和叶块放在灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上,25℃、黑暗条件下、恒温培养8~10天,得到多株内生真菌,采用26 s rDNA D1/D2区域和ITS rDNA测序鉴定菌株,筛选出抗氧化性较高的8株菌(表1)并构建其系统发育树。
2.2. 培养基与试剂
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基,马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基。
乙酸乙酯、无水乙醇均为国产分析纯,没食子酸、芦丁、水溶性维生素E来自中国药品生物制品鉴定所;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、过硫酸钾、甲醇、醋酸钠缓冲液、三氯化铁、福林酚、碳酸钠、氯化银。
2.3. 粗提物发酵及制备
在超净工作台上,将保留菌种接种到新PDA上开始活化,用打孔器在活化菌落边沿处打孔获得直径为6 mm菌饼,转接到装300 mL PDB的500 mL锥形瓶内,在25℃,130 rpm摇床内孵育8~10天。用减压抽滤法分离发酵液,收集菌液,然后用乙酸乙酯溶剂在12个小时之内等体积萃取3次,静置待分层后收集萃取液,40℃旋转蒸发浓缩,在烘箱内加热烘干得粗提物。称重,配制成1.0 mg/mL浓度供测试。
2.4. 抗氧化活性的研究
2.4.1. Trolox标准溶液的配制
母液:0.0626 g的Trolox标准品用无水乙醇定容到25 mL,浓度为10 mmol/L。
ABTS法中的Trolox标准溶液:200 µmol/L、400 µmol/L、600 µmol/L、800 µmol/L、1000 µmol/L、1200 µmol/L和1400 µmol/L。
DPPH法中的Trolox标准溶液:400 µmol/L、800 µmol/L、1200 µmol/L、1600 µmol/L、2000 µmol/L、2400 µmol/L和2800 µmol/L。
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Table 1. The Endophytic Fungus libraries of Noni
表1. 诺丽内生真菌样本库
a:L:叶;F:果实。The letter of L represents Noni leaf, and F is the meaning of Noni fruit。b:H:海口;D:儋州;S:三亚;Q:琼海:W:万宁。The letter of H, D, S, Q, W represents Haikou city, Danzhou city, Sanya city, Qionghai city and Wanning city, respectively
FRAP法中的Trolox标准溶液:800 µmol/L、1600 µmol/L、2400 µmol/L、3200 µmol/L、4000 µmol/L、4800 µmol/L和5600 µmol/L。
2.4.2. ABTS+∙自由基清除法(ABTS)
自由基的产生使用ABTS与K2S2O8反应体系 [8] 。ABTS自由基的制备:1) 配制7 mM ABTS:称0.0960 g ABTS粉末,用蒸馏水定容至25 mL;2) 配制140 mM K2S2O8:称0.3784 g K2S2O8,用ddH2O定容至10 mL。ABTS由5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 µL 140 mmol/L K2S2O8水溶液避光反应12 h后获得,该溶液提前24 h配制,必须当天使用。使用前用无水乙醇稀释,使吸光值在732 nm为0.70 ± 0.02。粗提液加到2 mL ABTS溶液中黑暗条件6 min,测定吸光值,以溶剂作为对照,最终结果以µmol/L Trolox等量抗氧化能力(Trolox equal antioxidant capacity TEAC)表示。
2.4.3. DPPH清除能力测定(DPPH) [9]
12.5 mg DPPH溶解到甲醇中,定容到100 mL,使用时稀释5倍到25 mg/L,现配现用。适当体积的粗提液加入2 mL DPPH甲醇溶液中,黑暗条件20 min后在517 nm测量吸光值,以提取溶剂作为对照,最终结果以TEAC表示。
2.4.4. 总还原能力测试(FRAP) [9]
TPTZ溶液的配制:由0.3 mol/L醋酸盐缓冲液25 mL,10 mmol/L TPTZ工作液25 mL,20 mmol/L FeCl3溶液25 mL组成。现用现配。适当体积的粗体液按次加入1 mL ddH2O 和1.8 mL TPTZ溶液,摇匀,水浴37℃反应10 min,593 nm测量吸光值,溶剂做对照。最终结果TEAC表示。
2.5. 抗氧化成分测定
2.5.1. 总多酚含量(TPC)测定
TPC测定使用福林–肖卡法 [10] 。待测粗提液0.05 mL放到5 mL的Eppendorf试管中,加入3.85 mL ddH2O,揺匀,再加0.25 mL FC (用前1:1稀释),充分揺匀,1 min之后,加入20%的饱和Na2CO3溶液0.75 mL,混匀,黑暗条件2 h,提取溶剂做对照,765 nm测量吸光值,三个重复,结果以没食子酸等价值(mg/100 g FW)表示。没食子酸标准溶液浓度:0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L,250 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L。
2.5.2. 总黄酮含量(TFC) 测定
总黄酮含量测定采用AlCl3显色法 [11] ,稍作修改。待测提取液0.3 mL加入5 mL Eppendorf试管中,然后分别加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3,1 mL pH为5.2的NaAC-HAC缓冲溶液,用甲醇定容至4 mL,摇匀,40℃水浴显色10 min,以0.1 mol/L AlCl3溶液为空白,采用紫外–可见分光光度法,510 nm测量吸光值,三个重复。结果以芦丁等价值(mg/100g FW)表示。芦丁标准溶液浓度:0.1 g/L,0.2 g/L,0.4 g/L,0.5 g/L,0.6 g/L,0.8 g/L,1 g/L。
2.6. 统计分析
DPPH、FRAP、ABTS法的抗氧化能力数据用Microsoft Excel版软件分析,TPC、TFC与其抗氧化活性之间的相关性分析用SAS V8。
2.7. DNA序列分析及系统发育树构建
登陆NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),利用BLAST将测序获得的霉菌以基于核糖体ITS区域的序列和酵母菌以基于26s rDNA D1/D2区域的序列,与GenBank中的已知序列进行比对,寻找相似度最高菌种,联合形态学特征,确定分离菌株的分类地位。并用MEGA 5.2.1软件按照邻接法(Neighbour-Joining,N-J),自展数(boostrap)为1000,构建系统发育树 [12] 。
3. 结果与分析
3.1. 清除DPPH自由基能力的测定
517 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = −0.0003x + 0.9403,R2 = 0.9978,表现出显著的量效相关性。DPPH是一种稳定的自由基,其溶液呈紫色,当与抗氧化剂反应时,溶液变为浅黄色,吸光度降低,是评价物质抗氧化性的常用方法之一。由表2可知,随着样品提取液浓度的增加,对DPPH的清除能力也在逐渐增加,说明样品提取液与清除DPPH的能力存在量效关系。m20、m18、j22、j20的自由基清除能力均较强,当体积为225 µl时,其清除率均 ≥ 30 mmol/L-Trolox/g DW,其余4种亦具有较强的清除能力。
3.2. ABTS+·自由基清除能力
732 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = −0.0004x + 0.6354,R2 = 0.9936 (图1),表现出显著的量效相关性。ABTS是一种较为稳定的自由基,其溶液呈蓝绿色,当有自由基清除剂存在时,ABTS溶液颜色变浅,吸光值减小。8种诺丽内生真菌均具有一定程度的ABTS活性(图2),其中j22和j19的自由基清除活性较强,在体积为18 µl时,清除率分别为10.92和9.71 mmol/L-Trolox/g DW。而同等稀释倍数下,其余5种皆具有一定的ABTS+·自由基清除能力。
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Figure 1. ABTS standard curve (732 nm)
图1. ABTS法标准曲线(732 nm)
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Figure 2. Determination of antioxidant activity of strains by ABTS
图2. ABTS法测定菌株的抗氧化活性
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Table 2. Determination results of DPPH free radical scavenging activity of crud extract
表2. 粗取物清除DPPH自由基能力的测定结果
3.3. FRAP总还原能力的测定
593 nm测定吸光值,所得标曲方程:y = 0.0001x + 0.2711,R2 = 0.9863 (图3),表现出显著的量效相关性。酸性情况下抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ生产蓝紫色的Fe2+-TPTZ,可作为样品总抗氧化能力的指标。如图4所示,其中j22和j19的还原能力最强,在体积为90 µl时,还原力分别为9.45和9.62 mmol/L。m19和m20也具有较强的还原能力。
3.4. TPC和TFC
于765 nm和510 nm处测定吸光度,标准品没食子酸、芦丁的浓度为横坐标(X),吸收值为纵坐标(Y)绘制标准曲线。所得线性回归方程为:y = 0.0013x − 0.0027,R2 = 0.9991 (图5),y = 1.4703x + 0.0152,R2 = 0.9966 (图6),表现出显著的量效相关性。
诺丽内生真菌提取物抗氧化活性成分TPC和TFC如图7所示,m18、j22、j19具有较高含量的总酚和总黄酮,在浓度为1.0 mg/mL时,m20的TPC含量达79.03 mg/g,m18和j22的TFC含量分别为144.49和158.97 mg/g。
3.5. 种属鉴定
通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库,进行BLAST比对霉菌ITS区域序列和酵母菌的26 s rDNA D1/D2区域序列,应用MEGA 5.2.1软件按照N-J法构建聚类分析树状图,序列相似性 ≥ 99%,即为相同种。已确定8个菌株的分类归属(图8和图9)。分别属于属于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)两个类群。3种酵母菌分属于嗜盐酵母属(Sterigmatomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula),5种霉菌属于刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢属(Cladosporium),还有m10、m19、m20未确定属。
4. 讨论
生活质量的不断提高,使人类对延缓衰老及治疗相关疾病日渐重视,渴望寻求安全、高效的清除自由基、活性氧等抗氧化天然产物已成了国内外研究热点。已有大量诺丽抗氧化活性物质的研究 [4] [5] [13] [14] [15] ,但在诺丽内生真菌抗氧化活性方面则较少报道。因此,本试验以诺丽果和叶中分离鉴定的8株内生真菌为对象,研究其抗氧化性,实验结果表明,诺丽8株内生真菌菌株的抗氧化活性均较强,
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Figure 3. FRAP standard curve (593 nm)
图3. FRAP法标准曲线(593 nm)
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Figure 4. Determination of antioxidant activity of strains by FRAP
图4. FRAP法测定菌株的抗氧化活性
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Figure 5. Gallic acid standard curve (765 nm)
图5. 没食子酸标准曲线(765 nm)
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Figure 6. Rutin standard curve (510 nm)
图6. 芦丁标准曲线(510 nm)
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Figure 7. Total TPC content and total TFC content of the crude extracts from 8 strain fungal endophytic. Note: Different letters indicated significant between each other p < 0.05)
图7. 8种内生真菌粗提物总多酚和总黄酮含量。注:不同字母表示彼此之间存在显著性差异(p < 0.05)
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Figure 8. Phylogenetic analysis based on rDNA ITS sequence
图8. 基于rDNA ITS序列的系统发育分析
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Figure 9. Phylogenetic analysis based on 26s rDNA D1/D2 sequence
图9. 基于26s rDNA D1/D2序列的系统发育分析
其DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力的最高值,分别为31.24 mmol/L-Trolox/g DW、10.92 mmol/L-Trolox/g DW和9.62 mmol/L,TPC、TFC的含量在1.0 mg/mL时范围值分别为17.99~79.03 mg/g,48.38~158.97 mg/g。经筛选其抗氧化活性较高的有三株菌m18、j19和j22,分布属于嗜盐酵母属(Sterigmatomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、枝孢属(Cladosporium)。可见诺丽内生真菌的菌株普遍具有抗氧化活性,故可作为筛选天然抗氧化剂开发的重要生物资源,也证明诺丽内生真菌可以产生较多抗氧化活性物质,与文献 [16] [17] 描述的植物内生真菌可以产生与植物本身相似或相同的生理活性物质相符。值得说明的是,并非所有的诺丽内生真菌都具有显著的抗氧化活性,而且其抗氧化产物以及抗氧化机理是否与其宿主植物诺丽相同,有待进一步探讨。
基金项目
海南省中药现代化专项:海巴戟内生真菌抗肿瘤活性的次生代谢产物研究[专项编号:(2015ZY15)]。
NOTES
*通讯作者。