环状RNA在肿瘤中的研究近况

Research Progress of circRNAs in Cancer

摘要: 环状RNA (circular RNAs, circRNAs)是一类通过反向剪接(backsplice)方式形成的非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)，大量存在于生物中。本文旨在综述circRNA的形成机制和特征、生物学功能及其在肿瘤中的作用。

Abstract: Circular RNAs (circRNAs) are noncoding RNAs (ncRNAs) formed by back splice, which are abun-dantly present in organisms. This article aims to review the mechanism and characteristics of circRNA, biological function and its role in the tumor.

1. 引言

非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)是指细胞内不编码蛋白质却行使多种生物学功能的RNA，而环状RNA(circular RNAs，circRNAs)大多为非编码RNA。20世纪70年代，circRNA首先在病毒中被发现 [1] 。但是，随后circRNA一直被认为是一类因转录过程中发生错误剪接而形成的低丰度RNA分子，因而对它们的研究不深。近年来，随着高通量测序技术等生物信息学的快速发展，环状RNA作为一种特殊的内源性非编码RNA，其可作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)参与到基因的表达调控中，成为继微小RNA(miroRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA，IncRNA)后的又一研究新热点 [1] 。本文旨在综述circRNA的形成机制和特征、生物学功能及其在肿瘤中的作用。

2. 环状RNA的形成机制

根据序列的来源不同，circRNA大致可分为外显子来源的环状RNA分子(exonic circRNAs)、内含子来源的环状RNA分子(ciRNAs)、由外显子和内含子共同组成的环状RNA分子(retained-intron circRNAs)。目前circRNA的加工成熟机制尚不完全清楚，推测外显子环状RNA通过反向剪接的方式形成，目前存在两种假设模型 [2] 。①外显子环状RNA形成过程中，前体RNA(pre-RNA)转录时发生了部分折叠，外显子随着RNA的折叠出现跳跃现象，这样在被跨越的部分形成外显子包含内含子的环状RNA中间体套索结构，接着套索内部通过剪接去除内含子序列后形成环状RNA。此种模型定义为套索驱动环化。②由于环状RNA的前体序列两侧内含子上存在反向互补序列，两侧内含子的互补配对介导了环状RNA的形成。此种模型定义为内含子配对驱动环化。关于内含子来源的环状RNA，目前认为，部分内含子在剪接作用中形成套索结构，但绝大多数会在脱分支作用下被很快降解，只有一些含关键核酸序列的内含子在剪接后不能被脱分支酶作用，形成内含子来源的环状RNA [3] [4] 。

CircRNA较线性RNA相比，没有5’末端和3端末端，呈闭合环状，故circRNA更具稳定性和高度保守性 [2] [5] 。关于circRNA的降解机制，有学者通过对培养细胞上清液circRNA的检测，表明circRNA可通过外泌体的形式分泌到胞外而被清除 [6] 。Hansen等证实circRNA也可被miRNA海绵样吸附，比如ciRS-7(也称CDR1as)与miR671结合后被降解 [7] 。

3. circRNA的生物学功能

近期研究表明，circRNA是具有功能的生物大分子，包括充当ceRNA来发挥miRNA海绵作用，亲本基因的调控，作为生物标记物等 [8] 。

3.1. circRNA是一种ceRNA

和mRNA、假基因一样，circRNA也含有miRNA应答元件，通过竞争性结合miRNA来调控各自的表达，从而调控基因的表达 [8] 。近年来，研究者推测circRNA也可作为一种新的ceRNA，参与到ceRNA的调控网络中。在人和小鼠的脑组织中，circRNA RS-7可以作为miR-7的分子海绵结合并抑制miRNA分子继而正向调控miR-7的靶基因；circRNASry能够结合并抑制miR-138从而正向调控miR-138的靶基因。但circRNA本身对miRNA介导的转录后调控并不敏感 [7] [9] 。可见，circRNA作为一种稳定的miRNA应答元件，能够更有效率得结合miRNA，是一种极为重要的ceRNA。

3.2. 参与亲本基因的调控

李兆勇等人通过研究表明，敲除EIciRNA(外显子-内含子RNA)会导致其亲本基因的mRNA水平及转录水平降低。EIciRNA调节亲本基因转录，要通过与PolII、U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)及基因启动子的相互作用。U1 snRNP阻断U1小核核糖核酸(U1 snRNA)会消除EIciRNA敲除对亲本基因mRNA水平的影响，并削弱PolⅡ与EIciRNA之间的关系，还会减少EIciRNA和亲本基因启动子的相互作用。U1 snRNA在EIciRNA上的结合位置是在保留的内含子的5’剪切位点上，阻断这个位置会减少U1 snRNA 与EIciRNA的相互作用 [3] [10] 。总之，U1 snRNA与EIciRNA通过相互作用形成EIciRNA-U1 snRNA复合物，此复合物在亲本基因启动子上与Pol Ⅱ转录复合物相互作用，以调控亲本基因的表达。

3.3. 作为新型生物标志物

随着全基因组测序时代的来临，新的测序手段定位RNA在基因组中的来源并通过去除rRNA对非多聚腺苷酸化的RNA进行测序 [11] [12] 。circRNA在结构上较线性RNA具有更高的稳定性，通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病的发生发展中发挥着重要作用，有望成为新型的疾病临床诊断标志物。近年发现，胃癌组织中has-circ-002059的表达明显低于周围无瘤组织；has-circ-0001649在肝癌组织中也表达异常 [13] [14] 。

4. circRNA与肿瘤

circRNA与多种疾病的易感性相关联，如肿瘤、糖尿病、神经系统疾病等 [15] 。circRNA在肿瘤的发生发展、侵袭转移及耐药等方面具有重要作用，并有望成为肿瘤诊断的新型分子标志物和治疗靶点。

4.1. circRNA与肝癌

Yu等研究发现，作为ciRS-7作为miR-7海绵，在肝癌组织中高表达，其抑制miR-7活性并竞争结合其他RNA，从而调控靶基因的表达 [16] 。Xu等发现ciRS-7的高表达与肿瘤微血管侵犯有着密切的关系，可能在肝癌转移机制的研究中有着重要作用 [17] 。Han等证实，circ RNA MTO1作为miR-9海绵，促进p21的表达从而抑制肝癌的发生发展 [18] 。Hsa_circ_0003570不仅在HCC细胞系中低表达(P < 0.001)，而且在HCC组织中也被发现低表达(P < 0.001)。此外，hsa_circ_0003570从慢性肝炎(CH)、肝硬化(LC)和HCC组织中表达(P < 0.01)逐渐减少。另外，其表达水平与肿瘤直径、分化、微血管侵犯显著相关 [19] 。有发现HCC的hsa_circ_0005986的表达水平明显低于相邻非肿瘤组织(P < 0.001)。而且，HCC细胞系、HepG2、SMMC7721、Huh7、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3的水平明显低于人类正常肝细胞系L02(P < 0.001)。此外，hsa_circ_0005986的低表达水平与慢性乙肝家族史(P = 0.001)、肿瘤直径(P < 0.001)、微血管侵犯(P = 0.026)、临床肝癌(BCLC)阶段(P < 0.001)有关 [20] 。国内高鹏骥等 [21] 发现，HCC组织中circRNA表达谱变化显著，其中has-circ-0043278和has-circ-0006220明显上调可能参与HCC的发生和进展。我们课题组应用circRNA芯片检测四对乙肝阳性的肝细胞癌组织及对应癌旁组织发现189个circRNA上调，37个circRNA下调，其中circRNA_100338高表达与患者累积生存率下降及转移进展密切相关，miR-141-3p吸附circRNA_100338促进肝癌细胞的侵袭潜能，因此，circRNA_100338可能是乙肝阳性的肝癌患者的诊断标志物和干预靶点；同时，借助大数据分析，我们发现转移抑制基因1(metastasis suppressor 1, MTSS1)是miR-141-3最可能的下游重要靶基因之一，因此，circRNA-100338/miR-141-3p信号通路在肝癌研究中具有潜在临床意义 [22] 。circRNA在HCC研究中的结果存在差异，可能与样本选择差异及肝炎病毒拷贝数有相关性，还需要进一步研究。

4.2. circRNA与胃肠癌

Li等证明了circ-104916的表达在胃癌组织和细胞系中被下调。circ-104916的较低表达出现在更深的侵入深度、更高的肿瘤分期和更频繁的淋巴管转移患者。circ-104916的过度表达有效抑制了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western blot显示circ-104916过表达上调e-cadherin和下调n-cadherin,Vimentin和Slug，表明circ-104916参与上皮-间质过渡过程 [23] 。HCT116和HT29细胞中cirs-7的过度表达导致mir-7的阻断，导致更有攻击性的致癌表型，cirs-7过表达允许mir-7的抑制和EGFR和RAF1致癌基因的激活。与正常的黏膜(P = 0.0018)相比，在结直肠癌组织中，cirs-7明显被上调(P = 0.0018)，而它的过度表达与患者的生存状况(P = 0.0224和0.0061，分别在实验和验证组中)有关联。多变量生存分析显示，cirs-7是总体生存的独立危险因素(P = 0.0656和0.0324，分别为实验和验证组) [24] 。Guo等首次使用定量聚合酶链反应的癌旁非癌组织来测定的hsa_circ_0000069的表达在肠癌组织。在肠癌组织中观察到hsa_circ_0000069的高表达，与患者年龄、肿瘤、淋巴结、转移(TNM分期)阶段(P < 0.05)有关。此外，通过在肠癌细胞中使用专门设计的siRNAs，进行了功能分析，发现hsa_circ_0000069的击倒可以明显抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导G0/G1细胞周期的停止 [25] 。Wang等使用ΔCt方法和调查之间的差异肿瘤组织和正常结肠粘膜配对t检验。对hsa_circ_001988表达水平与患者临床病理因素的关系进行了单向方差分析。发现hsa_circ_001988的表达与分化(P < 0.05)和会阴侵袭(P < 0.05)显著相关，表明hsa_circ_001988可能成为结肠直肠癌诊断的一种新的潜在生物标志物，是治疗大肠癌的潜在新靶点 [26] 。结直肠癌细胞系的功能研究方面，circCCDC66控制多种病理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭和独立生长。circCCDC66通过调控肿瘤基因的一个子集发挥其功能，并分别在异种移植物和原位小鼠模型中抑制circCCDC66抑制肿瘤生长和肿瘤侵袭 [27] 。

4.3. circRNA与其他肿瘤

食管鳞癌与circRNA的研究中，涉及多种circRNA，如has-circ-0067934 [28] ，circRNA ITCH [29] 等。为了研究环状RNA在卵巢癌中的作用，Ahmed对3例卵巢癌患者的主要位点、腹腔和淋巴结转移进行了RNA测序，发现上皮性卵巢癌中成千上万的环状异构体 [30] 。

5. 结语

circRNA作为非编码RNA家族的新成员，因其高丰度、稳定性和保守性越来越被科学家们重视。然而，目前检测circRNA的方法仍有局限性，编码、命名仍未统一，不同的生物信息学方法得出的结果仍有偏倚，需要多中心、大样本的临床验证。随着功能研究的不断深入，circRNA在疾病诊治，尤其在肿瘤的发生发展和防治研究方面的无限潜力，有望成为肿瘤早期诊断的生物分子标志和肿瘤治疗的新靶点，其参与肿瘤进展的分子机制也是重要的研究内容之一。

基金项目

中美联合培养学者/留学生转化医学课题(UCTMP2015-03C001)；国家自然科学基金面上项目(81272401)。