1. 引言
亲鱼的营养状况直接影响亲鱼的繁殖性能、胚胎发育和仔稚幼鱼的存活与品质 [1] 。因此,在亲鱼养殖阶段,营养强化至关重要。然而,由于亲鱼营养研究存在饲养设施要求高、耗时长、投入成本大等限制因素,导致亲鱼的营养学研究起步晚,研究要素仅局限在蛋白质、脂肪酸和维生素等几个方面,有关机理性研究鲜有报道;在生产实践中也通常凭借经验进行亲鱼营养强化,没有标准和依据可循。上述因素也成为了限制水产动物营养与繁殖研究领域发展的瓶颈问题。为了解决这一限制因素并拓展相关学科的发展,作者以细胞学为切入点,以调控亲鱼繁殖的生殖轴为靶目标,对其中发挥重要激素调控功能的垂体组织进行体外原代细胞培养,试图从细胞层面探讨相关营养素发挥生殖调控的作用机制,为亲鱼营养与繁殖研究的发展提供新思路和便捷的实验材料。
众所周知,除环境因素影响外,鱼类的生殖活动直接受到下丘脑–垂体–性腺(生殖轴)三个不同层次内分泌系统的调控 [2] 。在下丘脑分泌的促性腺激素释放激素作用下,激发了垂体分泌促性腺激素(促滤泡激素FSH和促黄体激素LH)并作用于性腺,促使其分泌性类固醇激素,以促使性腺发育成熟与排出精子和卵子 [3] 。那么,营养元素能够发挥调控作用的部位也离不开这条生殖轴。但是目前,相关研究主要侧重营养素对水产动物性腺发育、配子质量和后代质量的影响 [4] 。
垂体分泌的激素对鱼类生长、代谢和繁殖起到重要调控作用。垂体组织细胞的原代培养方法多应用于内分泌研究的相关领域,且在陆生动物中已成为常规的实验材料。原代培养的细胞保留了组织器官本身最大的生物活性和遗传特性,而且不受神经系统影响,反应的介质也易于控制和研究,节约实验用动物数量且细胞混合后的实验系统误差小,这些优势使得以原代细胞作为实验材料而广泛应用。目前,已经在几种鱼类中体外成功培养了垂体的原代细胞并应用于生殖内分泌研究,包括:鲤鱼、金鱼、斑马鱼、罗非鱼、虹鳟等 [5] [6] [7] [8] [9] 。在这些鱼类的垂体细胞原代培养方法中,具体的培养条件和一些参数因鱼的种类、生活环境等各异而不同。优化培养参数和条件能够获得功能更加稳定的细胞,使其应用于实验中发挥更大的功效。
半滑舌鳎(Cynoglossµs semilaevis)是我国近海特有的暖温性大中型底层鱼类,主要分布于黄海、渤海,生长速度快,肉味鲜美,营养价值很高 [10] 。近年来,半滑舌鳎已成为我国海水鱼类养殖的主导品种之一。但是,由于半滑舌鳎亲鱼繁殖性能较差,人工育苗中出苗率只有30%左右 [11] ,严重制约半滑舌鳎养殖业发展。有必要加强其亲鱼营养的研究,尤其是机理方面的研究,使得亲鱼营养调控精准化、科学化。目前,有关半滑舌鳎组织器官的细胞培养只见卵巢、精巢、头肾、脾脏、肝脏、心脏、血淋巴等报道 [12] - [17] ,垂体细胞原代培养未见相关研究。本实验通过开展半滑舌鳎垂体细胞原代培养研究,优化其培养条件,获得了稳定的原代细胞,为其日后开展的细胞功能应用性研究奠定基础,为亲鱼营养调控机制研究提供便捷的实验材料。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
半滑舌鳎雌鱼(卵巢发育至III期)购自莱州明波水产有限公司,选取性腺隆起、体重2.5 kg左右的健康亲鱼10条;同时还购买体重1 kg左右的雌鱼6条为实验用鱼。
2.2. 亲鱼卵巢切片制备
取卵巢组织,用Davidedsons固定液固定24小时,经梯度酒精脱水后,进行石蜡包埋、冷冻切片及HE染色,使用中性树脂封片,通过显微镜观察、拍照确定性腺发育时期。
2.3. 亲鱼垂体细胞的分离与培养
2.3.1. 配制细胞培养液
取9.6 g L-15培养基和4.76 g Hepes溶于水,充分溶解混匀4 h后,用NaOH调节pH为7.4,然后抽滤,分装,即为L-15基础培养基,4℃保存;L-15基础培养基中加入终体积为5%的胎牛血清、终浓度为100 U/mL的青霉素和终浓度为100 μg/mL的链霉素,即为L-15完全培养基,4℃保存。
2.3.2. 细胞分离
由于亲鱼取材的特殊性及其价格比较昂贵,在培养温度的选择方面直接参考经筛选过的半滑舌鳎血淋巴、肝脏和卵巢组织的最佳培养温度24℃。摘取卵巢发育处于III期的半滑舌鳎的垂体,置于装有L-15完全培养基的一次性细胞培养皿中,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一次,将垂体组织剪成大约1 mm3的小块,采用两种常用的细胞分离方法进行分离。 组织块分离方法:将3条鱼的垂体剪成的1 mm3小块用L-15完全培养基均匀接种于25 cm2培养瓶中,倒置放6h后加入3 mL L-15完全培养基正置于24℃培养箱培养。 胰蛋白酶消化法:将7条鱼的垂体剪成的1 mm3小块,再用PBS冲洗一次,加入约组织块10倍体积的0.25%的胰蛋白酶在18℃水浴中消化45 min,加入2 mL PBS吹打,然后用200目/70 μm的尼龙网过滤,收集滤液,以100 g/min的速度离心10 min后,去上清然后重悬沉淀,按照1 mL/孔的量分装至六孔板中,正置于24℃培养箱中培养。
2.3.3. 细胞培养
在培养的6孔中,其中2孔添加生长因子(2-巯基乙醇和成纤维生长因子,终浓度分别为50 mmol/L和10 ng/mL),2孔添加无水乙醇(终浓度为0.1%,v/v) [18] ,其余2孔无添加(对照)。培养后第2,3,7天连续观察细胞生长情况,倒置显微镜观察拍照记录,最终放大100倍镜。
2.4. 成鱼垂体细胞的分离与培养
按照上述亲鱼垂体细胞的分离培养方法,采用胰蛋白酶消化法分离垂体细胞,最终置于六孔板中24℃培养箱中培养(不添加生长因子),第2,3,7天连续观察细胞生长情况。
2.5. FSH和LH的酶联免疫吸附法(ELISA)分析
培养7天后,将每孔垂体细胞转移至15 mL离心管中,以100 g/min的速度离心10 min之后,上清用于ELISA实验分析,取2个检测孔的平均值作为结果。
采用北京冬歌博业生物科技有限公司的鱼促滤泡激素(FSH)ELISA检测试剂盒和鱼促黄体激素(LH)ELISA检测试剂盒,取上述培养的细胞上清液为材料,按照试剂盒说明书进行操作。
3. 结果
3.1. 卵巢组织切片
实验用半滑舌鳎亲鱼性腺组织切片如图1所示。鱼体解剖后,卵巢呈亮乳白色,表面血管丰富,卵巢体积明显增大,总体仍为扁平状,前部膨胀延长,呈三角形。切片观察,卵母细胞形态基本呈圆球形,细胞体积明显增大。一个较为明显的特征是皮质液泡的出现、增加和移位。液泡出现在细胞质外缘,逐渐向内缘移位。卵黄颗粒出现并不断增加。说明实验用半滑舌鳎亲鱼卵巢发育处于III期。
3.2. 亲鱼垂体细胞分离
分别采用组织块分离法和胰蛋白酶消化法进行细胞分离。细胞观察发现组织块分离法只有少量细胞迁出,无法进行后续实验,分离失败。胰蛋白酶消化法获得的细胞杂质少,镜检观察视野清晰,细胞均匀分散,利于后期对细胞进行的处理实验,如图2所示。
3.3. 亲鱼垂体细胞培养
分别在细胞培养液中添加生长因子(促进细胞生长)和无水乙醇(细胞处理实验时作为脂溶性物质的溶剂)。结果表明,添加生长因子培养的细胞与对照组比数量明显减少,不足支撑后续的细胞实验(图3(a));而添加无水乙醇培养的细胞与对照组比,在细胞形态和数量上没有差异(图3(b));图3(c)为对照组细胞。
3.4. 成鱼垂体细胞分离和培养
采用胰蛋白酶消化法分离垂体培养细胞,未添加生长因子,观察发现,细胞生长良好,形态饱满,如图4所示。
![](//html.hanspub.org/file/2-1030076x9_hanspub.png)
Figure 1. The tissue slice of Cynoglossus semilaevis ovary development on stage III
图1. 半滑舌鳎亲鱼卵巢发育Ⅲ期组织切片图
![](//html.hanspub.org/file/2-1030076x10_hanspub.png)
Figure 2. The primary culture on pituitary cells of Cynoglossus semilaevis broodstock fish (100×)
图2. 半滑舌鳎亲鱼卵巢发育III期组织切片图(100倍镜)
(a) (b) (c)
Figure 3. The primary culture on pituitary cells of Cynoglossus semilaevis broodstock fish (100×), (a) addition of growth factors, (b) addition of ethanol, (c) control
图3. 不同物质对半滑舌鳎亲鱼垂体组织细胞原代培养的影响(100倍镜);(a) 添加生长因子,(b) 添加无水乙醇,(c) 对照组
![](//html.hanspub.org/file/2-1030076x12_hanspub.png)
Figure 4. The primary culture on pituitary cells of Cynoglossus semilaevis adult fish (100×)
图4. 半滑舌鳎成鱼垂体组织细胞原代培养(100倍镜)
3.5. FSH和LH的ELISA检测结果
图5和图6表明,亲鱼组中添加乙醇(终浓度为0.1%,v/v)的细胞培养上清中FSH和LH的含量与对照组无差异,成鱼组FSH和LH的含量比亲鱼组低。
4. 讨论
组织的原代培养细胞最接近其在体内的生长状态,也最能反映出其在体内的生长特性,并最好保留
![](//html.hanspub.org/file/2-1030076x13_hanspub.png)
Figure 5. The content of FSH in the supernatant of primary culture pituitary cells on Cynoglossus semilaevis
图5. 半滑舌鳎垂体组织细胞原代培养上清液中FSH的含量
![](//html.hanspub.org/file/2-1030076x14_hanspub.png)
Figure 6. The content of LH in the supernatant of primary culture pituitary cells on Cynoglossus semilaevis
图6. 半滑舌鳎垂体组织细胞原代培养上清液中LH的含量
其生物活性和遗传特性,适于应用其研究细胞的功能和调控机制等,为生物学实验提供便捷的实验材料,尤其是对于亲鱼等取材特殊、样品昂贵的实验动物来说无疑是比较理想的一种实验途径。本研究在系统的综合了多种鱼类垂体细胞原代培养方法的基础上,根据半滑舌鳎的特性,经过适宜调整和改进,建立了半滑舌鳎垂体原代细胞培养方法,体外培养可达到7天以上,并能分泌促性腺激素FSH和LH,完全可以应用其开展细胞功能研究的相关实验。
细胞培养的最适温度选择是在该鱼种的适宜生长温度范围内。半滑舌鳎适宜生长温度范围为14℃~24℃,先前对这条鱼的肝脏和卵巢等组织的研究表明其最适宜的体外细胞培养温度为24℃ [12] [13] ,因此本实验采用在24℃条件下培养,能够保证细胞的最大活力。斑马鱼适宜的生长温度为26.5℃~28.5℃,Lin和Ge [7] 对斑马鱼垂体细胞进行原代培养选择温度为28℃;虹鳟的适宜的生长温度为12℃~18℃,Weil[9]对虹鳟垂体组织进行细胞原代培养的温度为12℃;鲤鱼的适宜生长温度为25℃~27℃,Ribeiro等 [5] 在25℃条件下对鲤鱼垂体组织进行原代培养。由此可见,鱼种的适宜生长温度通常是细胞培养温度选择的重要依据。
由于垂体组织柔软且纤维成分少,在细胞分离时考虑采用组织块分离方法和胰蛋白酶消化法。通常,组织块法具有操作简单易行、存活率较高、纯度较高、实验重复性高等优点,而消化酶法的实验操作复杂、消化酶作用时间不易掌握、消化酶本身对细胞可能会有一定的负作用,但应用酶的生化作用可进一步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,易于形成细胞悬液,利于贴壁培养 [19] 。本实验发现,组织块法分离只有少量细胞迁出,无法进行后续实验,其原因尚不明确,可能是垂体组织不适合应用此方法进行细胞分离;而胰蛋白酶消化法分离的细胞杂质少、细胞分散均匀且能够分泌激素。因此,对于半滑舌鳎垂体组织建议应用胰蛋白酶消化法进行细胞分离。
细胞生长因子2-巯基乙醇对细胞的生长和增殖有很重要的作用,同时避免过氧化物对培养细胞的损害;成纤维生长因子是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类物质 [19] 。本研究发现,加入生长因子时不利于细胞的培养,细胞数量减少。加入生长因子通常都是促进细胞的生长和传代,而垂体细胞很难传代培养(有关垂体细胞培养的文献基本都是原代培养),因此加入生长因子可能起到了负作用。所以,建议在半滑舌鳎垂体细胞分离培养过程中不添加生长因子。
Rimbach等在体外培养白化病小鼠肝细胞时,在培养液中加入终浓度为0.1%(v/v)的无水乙醇对细胞无影响 [18] 。本研究中,在垂体细胞培养液中加入无水乙醇(终浓度为0.1%,v/v)对细胞也没有影响,可以在研究细胞功能过程中向培养液中添加脂溶性物质,如维生素E等。本研究采用相同的方法,体外原代培养半滑舌鳎成鱼的垂体细胞,同样能够维持细胞在体外正常培养7天以上,且能够分泌促性腺激素,说明本研究建立的半滑舌鳎垂体细胞体外原代培养方法适用于亲鱼和成鱼。
由于亲鱼取材的特殊性,亲鱼营养研究也受到多种条件的制约,导致相关学科发展缓慢。本实验建立的半滑舌鳎垂体细胞原代培养方法,可以在体外培养垂体细胞,通过向其培养液中添加外源性营养素(如维生素E)的方式来研究其对垂体激素分泌调控的影响,进而从细胞层面探讨亲鱼营养作用机制和调控机理,同时为亲鱼营养研究提供便捷高效的实验材料,也提供了新思路,为丰富和发展相关学科奠定了基础。
5. 结论
垂体细胞原代培养的适宜筛选条件:将半滑舌鳎的垂体置于装有L-15完全培养基的一次性细胞培养皿中,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一次,将垂体组织剪成大约1 mm3的小块,再用PBS冲洗一次,加入约组织块10倍体积的0.25%的胰蛋白酶在18℃水浴中消化45 min,加入2 mL PBS吹打,然后用200目/70 μm的尼龙网过滤,收集滤液,以100 g/min的速度离心10 min后,去上清然后重悬沉淀,按照1 mL/孔的量分装至六孔板中,正置于24℃培养箱中培养。
基金项目
国家自然科学基金项目(31502177, 31201982, 31602133);国家鲆鲽类产业技术体(CARS-50);中国水产科学研究院基本科研业务费(2016GH03, 2017HY-ZD0608)资助。