1. 引言
小鼠小胶质细胞(BV2)：小胶质细胞是神经胶质细胞之一，是正常中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞，其在脑部分布非常广，其数量占脑内所有胶质细胞的5%~20%。目前的研究表明，胶质细胞对中枢神经系统的防御和组织修复有重要意义 [1] [2] 。通过产生生长因子促进神经元的存活，并调节内源性免疫系统 [3] 。此外，作为促炎细胞因子的主要来源，小胶质细胞是神经炎症的关键介质，可以诱导或调节广泛的细胞反应 [4] [5] 。
小胶质细胞对研究阿尔茨海默病的发生与治疗具有重要意义。目前多数学者认为：β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)沉积的过度产生使得神经胶质细胞过度活化，引起脑内慢性炎症反应及小胶质细胞吞噬降解功能下降可能是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)发病的核心病理机制之一 [6] 。在AD脑内处于慢性炎症状况下的微环境，若损伤因素持续存在，小胶质细胞持续地激活和致炎性细胞因子持续地过表达，引起神经元退行性变、局部的小胶质细胞激活及炎症参与的神经元退行性变的持续发展 [7] [8] [9] ，从而加剧阿尔茨海默病(AD)和多发性硬化(MS)的恶化 [10] [11] 。因此，如何在抑制小胶质细胞过度活化产生炎症因子的同时，提高小胶质细胞的吞噬降解功能可能成为阿尔茨海默病治疗的重要策略。为此研究能够提高小胶质细胞吞噬降解功能的方法和机制具有重要意义。
硒(Se)是人类和哺乳动物必不可少的微量元素，在人体蛋白质翻译过程中以硒代半胱氨酸(Selenocysteine, Sec)的形式插入氨基酸序列中形成硒蛋白(selenoprotein) [12] 。人体内共有25种硒蛋白，其中一部分是位于内质网上的膜蛋白，硒蛋白K (Selenoprotein K, SELENOK, SelK)是一种分子量为12 kDa的位于内质网和高尔基体上的膜蛋白。一些学者研究也发现，硒蛋白SelK主要在巨噬细胞、小胶质细胞等免疫细胞中大量表达 [13] [14] 。Verma S等 [15] 的进一步研究表明，SelK在小鼠脾脏等免疫组织中的表达量最高，敲除SelK基因的小鼠体内免疫细胞的多种功能发生障碍，免疫力减弱，由此推测硒蛋白SelK与小胶质细胞的吞噬降解功能有关。但是硒蛋白SelK增强免疫细胞功能的机制一直是亟待解决的重要问题之一。
近期研究发现硒蛋白SelK与棕榈酰基转移酶ZDHHC6具有很强的结合能力，并且能够通过与ZDHHC6的结合促进CD36 [16] [17] [18] 、三磷酸肌醇受体IP3R [19] [20] [21] 、类凝集素伴侣钙联蛋白Calnexin [22] [23] [24] 和ASAP2 [25] 等与免疫细胞吞噬降解功能密切相关蛋白质的棕榈酰化。CD36为脂肪酸转位酶和免疫细胞模式识别之一，能够提高免疫细胞对吞噬底物的识别能力 [18] [26] ，CD36在免疫细胞中高表达 [16] 。IP3R为内质网钙库钙离子通道蛋白之一，除了能够促进内质网中Ca2+向细胞质释放外还能够增强向线粒体释放，从而通过促进线粒体中ATP产生提高免疫细胞吞噬能力 [22] [27] [28] 。Calnexin棕榈酰化后通过与线粒体相关内质网膜上蛋白质SERCA2b的结合维持线粒体的功能提高免疫细胞的吞噬功能 [22] [23] [29] 。而ASAP2的棕榈酰化能够使免疫细胞的细胞骨架蛋白发生有利于吞噬的改变 [25] [30] 。而关于硒蛋白SelK介导的CD36和Calnexin棕榈酰化是否促进这两种蛋白质表达和mRNA转录水平的升高尚没有人进行研究，上述研究对阐明硒蛋白SelK提高免疫细胞吞噬降解功能的机制及在防治阿尔茨海默病方面的作用具有重要意义。
2. 材料与方法
2.1. 细胞株
实验中用到的免疫细胞是小鼠小胶质细胞(BV2)，购买自国家生物医学实验细胞资源库。
2.2. 主要试剂
2.2.1. SelK过表达腺病毒载体
委托汉恒生物科技(上海)有限公司构建硒蛋白SelK过表达腺病毒载体，pHBAD-EF1-MCS-3flag- CMV-RFP载体图谱信息见图1，目的基因片段为SelK-Eco/Nhe：TCCAGACCCGGGACCGCCACC以及GATCAGCTCGCTCATGCTAGC。
2.2.2. SelK敲减慢病毒载体
委托上海吉凯基因科技有限公司构建硒蛋白SelK敲减慢病毒载体(RNA干扰载体)，目的基因RNA干扰慢病毒载体使用的是GV298，载体元件顺序为U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin (图2)，针对SelK设计的靶点序列为CGAAGAATGGGTAGGATCA。
2.3. 实验方法
2.3.1. 构建BV2细胞的硒蛋白SelK过表达/减表达模型
使用硒蛋白SelK过表达腺病毒载体转染免疫细胞BV2，在荧光显微镜下考察其对免疫细胞转染，Western blot验证过表达后的SelK的表达量是否上调。
使用硒蛋白SelK减表达慢病毒载体转染免疫细胞BV2，在荧光显微镜下考察其对免疫细胞转染，Western blot验证过表达后的SelK的表达量是否下调。
通过SelK的表达量变化确定模型构建成功后，考察SelK主要的降解酶Calpain表达量的变化，进而考察棕榈酰化修饰相关的ZDHHC6、CD36和Calnexin表达量的影响。
Figure 1. Mapping of the SelK overexpression adenoviral vector
图1. SelK过表达腺病毒载体图谱
Figure 2. Mapping of the SelK knockdown lentiviral vector
图2. SelK敲减慢病毒载体图谱
2.3.2. CCK8法测定细胞存活率
细胞存活率使用CCK8法试剂盒(Dojindo，日本)进行测定，首先将BV2细胞以5×104的细胞密度，接种到96孔板中，每组6个复孔，24小时后进行梯度MOI(复感染指数，代表病毒对细胞的感染能力)病毒转染，同时设置病毒载体阴性对照组(negative control, NC)。感染24 h后换为CCK-8试剂与全培养基(体积比1:9)混合工作液，37℃温箱孵育30 min，使用酶标仪测量96孔板在450 nm处吸光度后，将相应的吸光度值代入到(实验孔–对照组)/(对照组–空白孔)再乘以100%即可得到细胞存活率，其中实验孔含培养基、CCK-8试剂、细胞和病毒，对照组含培养基、CCK-8试剂和细胞，空白孔含培养液和CCK-8试剂，不含细胞和病毒。
2.3.3. 实时定量PCR
用1 mL的TRIzol试剂(Invitrogen，美国)在冰盒上吹打6孔板内的细胞。使用氯仿、异丙醇和75%乙醇提取并纯化细胞总RNA。使用带有gDNA Eraser的PrimeScript™ RT试剂盒(Takara，日本)进行cDNA逆转录。使用TB Green® Premix Ex Taq™ II (Takara，日本)在Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR检测系统(BioRad，美国)上进行实时定量PCR分析。扩增产物的步骤如下：95℃ 30 s，40循环：95℃ 5 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s。PCR引物是用PrimerBank设计的。所用引物序列见表1 (5'-3')。
2.3.4. Western Blot
使用含有1% PMSF (100 mM)、1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的全蛋白提取试剂盒(凯基，中国)提取6孔板内的细胞的全蛋白，在冰上充分裂解后离心，收集蛋白上清液。用BCA蛋白定量分析试剂盒(凯基，中国)测定蛋白质浓度，然后将蛋白上清液与5×SDS-PAGE Loading buffer混合，在100℃下煮沸10 min。
等量蛋白质样品经12.5% SDS-PAGE电泳分离后转移到0.2 µm疏水性PVDF转印膜(Millipore，美国)上。浸泡在QuickBlock™快速封闭液(碧云天，中国)中室温孵育20 min，将抗体盒置于4℃冰箱孵育一抗过夜，其中用一抗稀释液配置的一抗稀释比例如下：β-actin (1:10000，正能，中国)，SelK (2 μg/mL，ProSci，美国)，Calnexin (1:10000，三鹰，中国)，Calpain 2 (1:5000，三鹰，中国)，CD36 (1:1000，三鹰，中国)，ZDHHC6 (1:1000，赛默飞，美国)。转天回收一抗后用TBST缓冲液冲洗条带3次。然后，用过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG (1:5000，中杉金桥，中国)在室温下孵育1 h，再用TBST缓冲液清洗3次。使用Pro-light HRP化学发光试剂盒(亚科因，中国)检测目标蛋白，并用Bio-Rad Multi化学发光系统显色。
β-actin作为对照，用于归一化各蛋白的相对表达量。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad，美国)对条带进行量化分析。
2.3.5. 统计分析
每组n = 3，数据以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism 9 (GraphPad Software，美国)进行统计分析和图形表示，并通过单因素方差分析进行评估，然后进行Tukey检验，p < 0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. SelK过表达/敲减病毒对BV2细胞形态学的影响
由于小胶质细胞对外来物质非常敏感，采用质粒作为表达载体转染过程非常容易造成细胞的异常活化，而病毒载体则影响很小，因此设计了针对小鼠小胶质细胞转染的SelK过表达腺病毒载体以及SelK敲减慢病毒载体。图3(A)为空白组的小胶质细胞的细胞形态以及转染情况示例(无荧光)；图3(B)为SelK过表达组的小胶质细胞的细胞形态以及转染情况；图3(C)为SelK敲减组的小胶质细胞的细胞形态以及转染情况。在普通明场显微镜下观察到给予病毒(MOI 100)后的小胶质细胞形态稍有变化，有活化的可能，因此病毒剂量需要调低。
Figure 3. Transfection of SelK overexpression/knockdown adenovirus vector. (A) Examples of cell morphology of microglia in the Control group. (B) Examples of cell morphology and transfection of microglia in SelK overexpression group (MOI 100). (C) Examples of cell morphology and transfection of microglia in SelK knockdown group (MOI 100)
图3. SelK过表达/敲减腺病毒载体转染情况(A) 空白组小胶质细胞的细胞形态以及转染情况示例。(B) SelK过表达组小胶质细胞的细胞形态以及转染情况示例(以MOI 100为例)。(C) SelK敲减组小胶质细胞的细胞形态以及转染情况示例(以MOI 100为例)
3.2. SelK过表达/敲减病毒对BV2细胞活性的影响
由于观察到MOI 100下细胞形态变化，因此需要利用CCK8来检测病毒载体对细胞存活率的影响，来摸索一个对细胞“安全”的转染范围。通过图4(A)可以观察到，小胶质细胞对于接种梯度浓度的SelK过表达腺病毒转染后，MOI在200以内细胞存活率均在半数以上，MOI在100以内细胞存活率均接近100%。通过图4(B)可以观察到，不同浓度梯度的SelK敲减慢病毒载体对细胞存活率基本没影响。因此综合考虑，MOI应选在100以内用于后续实验，除空白组外，将病毒转染的分组分为MOI 25、50、75和100。
Figure 4. Effect of SelK overexpression/knockdown adenovirus vector transfection on BV2 survival of microglia. (A) Effect of SelK overexpression adenoviral vector on microglial survival. (B) Effect of SelK knockdown lentiviral vector on microglial survival
图4. SelK过表达/敲减腺病毒载体转染对小胶质细胞BV2存活率的影响。(A) SelK过表达腺病毒载体对小胶质细胞存活率的影响。(B) SelK敲减慢病毒载体对小胶质细胞存活率的影响
3.3. SelK过表达/敲减病毒对BV2细胞分泌的SelK mRNA与蛋白表达量的影响
如图5(A)、图5(B)所示，通过RT-qPCR实验测定小胶质细胞中SelK的变化，实验中设置了转染了空载体的阴性对照(Negative control)组，实验发现，阴性对照组与空白组(Control)对细胞SelK的表达没有影响，SelK过表达组的小胶质细胞mRNA样品在MOI 25时就表达出更多的SelK。紧接着，利用小胶质细胞的蛋白质样品，通过Western Blot实验观察到转染SelK过表达病毒后会表达出更多的SelK蛋白。同样地，SelK敲减组的小胶质细胞样品在MOI 25时开始表达出更少的SelK mRNA与蛋白(图5(C)、图5(D))。实验结果符合病毒转染后的预期，可以继续用来验证。
Figure 5. Effect of SelK overexpression/knockdown virus vector transfection on SelK expression in microglia BV2. (A) Statistical results of SelK overexpression adenoviral vector on mRNA in microglia. (B) Representative bands and statistical results of immunoblotting of SelK overexpression adenoviral vector on microglia protein expression. (C) Statistical results of SelK knockdown lentiviral vector on microglia mRNA. (D) Representative bands and statistical results of immunoblotting of microglia protein expression by SelK knockdown lentiviral vector. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001 vs. Control
图5. SelK过表达/敲减病毒载体转染对小胶质细胞BV2中SelK表达的影响。(A) SelK过表达腺病毒载体转染小胶质细胞mRNA的统计结果。(B) SelK过表达腺病毒载体转染的小胶质细胞蛋白表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。(C) SelK敲减慢病毒载体转染的小胶质细胞mRNA的统计结果。(D) SelK敲减慢病毒载体转染的小胶质细胞蛋白表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001或****P < 0.0001 vs. Control组
3.4. SelK过表达/敲减病毒对BV2细胞分泌的棕榈酰基转移酶ZDHHC6表达的影响
如图6(A)所示，随SelK蛋白的增多，SelK过表达组的小胶质细胞样品在MOI 50以后表达出更多的ZDHHC6蛋白。同样地，随SelK蛋白的减少，SelK敲减组的小胶质细胞样品在MOI 50时开始表达出更少的ZDHHC6蛋白(图6(B))。实验结果证明ZDHHC6的表达量会随着SelK表达量的多少而变化。
Figure 6. Effect of SelK overexpression/knockdown on the expression of ZDHHC6 in microglia BV2. (A) Representative bands and statistical results of immunoblotting of ZDHHC6 protein expression in microglia transfected with SelK overexpressing adenoviral vector. (B) Representative bands of immunoblotting and statistical results of ZDHHC6 protein expression in microglia transfected with SelK knockdown lentiviral vector. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001 vs. Control
图6. SelK过表达/敲减对小胶质细胞BV2中ZDHHC6表达的影响。(A) SelK过表达腺病毒载体转染的小胶质细胞中ZDHHC6蛋白表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。(B) SelK敲减慢病毒载体转染的小胶质细胞中ZDHHC6蛋白表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001或****P < 0.0001 vs. Control组
3.5. SelK过表达/敲减病毒对BV2细胞分泌的清道夫受体CD36和钙粘蛋白Calnexin表达的影响
Figure 7. Effect of SelK overexpression/knockdown on the expression of Calnexin in microglia BV2. (A) Statistical results of CD36 mRNA in microglia transfected with SelK overexpression adenovirus vector. (B) Representative bands and statistical results of CD36 protein expression in microglia transfected with SelK overexpression adenoviral vector. (C) Statistical results of CD36 mRNA in microglia transfected with SelK knockdown lentiviral vector. (D) Representative bands and statistical results of CD36 protein expression in microglia transfected with SelK knockdown lentiviral vector. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001 vs. Control
图7. SelK过表达/敲减对小胶质细胞BV2中CD36表达的影响。(A) SelK过表达腺病毒载体转染小胶质细胞中CD36编码mRNA的统计结果。(B) SelK过表达腺病毒载体转染的小胶质细胞中CD36蛋白质表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。(C) SelK敲减慢病毒载体转染小胶质细胞中CD36编码mRNA的统计结果。(D) SelK敲减慢病毒载体转染小胶质细胞中CD36蛋白质表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001或****P < 0.0001 vs. Control组
Figure 8. Effect of SelK overexpression/knockdown on the expression of Calnexin in microglia BV2. (A) Statistical results of Calnexin mRNA in microglia transfected with SelK overexpression adenovirus vector. (B) Representative bands and statistical results of Calnexin protein expression in microglia transfected with SelK overexpression adenoviral vector. (C) Statistical results of Calnexin mRNA in microglia transfected with SelK knockdown lentiviral vector. (D) Representative bands and statistical results of Calnexin protein expression in microglia transfected with SelK knockdown lentiviral vector. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 or ****P < 0.0001 vs. Control
图8. SelK过表达/敲减对小胶质细胞BV2中Calnexin表达的影响。(A) SelK过表达腺病毒载体转染小胶质细胞中Calnexin编码mRNA的统计结果。(B) SelK过表达腺病毒载体转染的小胶质细胞中Calnexin蛋白质表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。(C) SelK敲减慢病毒载体转染小胶质细胞中Calnexin编码mRNA的统计结果。(D) SelK敲减慢病毒载体转染小胶质细胞中Calnexin蛋白质表达量的免疫印迹代表条带及统计结果。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001或****P < 0.0001 vs. Control组
如图7、图8所示，在给予SelK过表达病毒载体后，随SelK表达量的增加，小胶质细胞BV2中CD36和Calnexin的mRNA与蛋白质表达量均大幅升高(CD36，图7(A) & 7(B))和(Calnexin，图8(A) & 8(B))。
在给予SelK敲减病毒载体后，随SelK表达量的减少，小胶质细胞BV2中CD36和Calnexin的mRNA与蛋白质表达量均大幅下降(CD36，图7(C) & 7(D))和(Calnexin，图8(C) & 8(D))。实验结果证明CD36和Calnexin的表达量与SelK以及ZDHHC6蛋白表达量的多少正相关。
4. 讨论
由上述实验结果可以得出：硒蛋白SelK的过表达可以显著提高与棕榈酰化修饰相关的ZDHHC6的蛋白质表达和mRNA转录，进而显著提高小胶质细胞与吞噬功能直接相关的吞噬细胞模式识别受体CD36的表达和mRNA转录，同时促进与Ca2+转运相关的钙粘蛋白Calnexin的稳定表达和mRNA转录。并且如预期一样在SelK敲减的小胶质细胞中CD36和Calnexin的蛋白质表达和mRNA转录水平显著下降。再结合前人关于硒蛋白SelK能促进CD36和Calnexin等蛋白S-棕榈酰化的研究结果，可以看出，硒蛋白SelK是通过棕榈酰基转移酶ZDHHC6促进CD36和Calnexin蛋白的棕榈酰化，显著提高CD36和Calnexin蛋白的稳定表达，从而提高免疫细胞的吞噬功能的。
基金项目
本研究得到了国家自然科学基金(编号：31371085和81503085)、辽宁省教育厅基金(编号：LYB201610)的资助。
NOTES
*通讯作者。