1. 引言
辣椒是中国重要的蔬菜之一，播种面积达到世界辣椒总播种面积的35%，产量为世界辣椒产量的46%，是我国重要的蔬菜之一 [1] 。辣椒是一种富含辣椒碱类、维生素类、多酚、黄酮等活性功能物质的一年生或多年生草本植物，近年来越来越多的研究发现其在糖脂代谢的调节方面具有一定疗效 [2] [3] [4] 。本实验以秀丽隐杆线虫为模型，探索辣椒提取物质对秀丽隐杆线虫降糖降脂以及抗氧化的影响，旨在为挑选优良辣椒品种，研究辣椒潜在功能因子等提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料与设备
E. coli OP50，购自CGC (Caenorhabditis Genetics Center)；秀丽隐杆线虫，购自CGC (Caenorhabditis Genetics Center)；降糖辣椒由金华农科院提供；氯化钠、多聚蛋白胨、琼脂粉、亚硝酸钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸钾、胆固醇、对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、α-葡萄糖苷酶、芦丁对照品、硝酸铝、福林酚试剂、没食子酸、苯酚、浓硫酸等；立式压力蒸汽灭菌器，隔水式恒温培养箱，ML31生物显微镜，电子天平，TGL-16离心机，紫外可见分光光度计，旋转蒸发仪等。
2.2. 实验方法
2.2.1. 降糖辣椒功能因子提取与鉴定
样品预处理方法：将辣椒果实冻干，称量，粉碎，辣椒粉过80目筛，移入干燥器备用。
1) 黄酮类化合物
天然黄酮类化合物以其在抗衰老、抗肿瘤、抗炎、肝脏保护和降血糖方面的高活性成为糖尿病防治研究热点 [5] [6] [7] 。在抗氧化模型方面，关淑文等 [8] 表明苜蓿所富含的黄酮类营养活性物质具有抗氧化功能。植物黄酮类可以有效防止糖尿病及其并发症。曹稳根等 [9] 通过α-葡萄糖苷酶活性抑制实验及四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，证实了枣子叶总黄酮具有显著的降糖活性。
本实验以冷冻干燥后的降糖辣椒粉末为原料，利用超声波提取法来提取降糖辣椒中的粗黄酮组分 [10] 。将辣椒果实冻干，称量，粉碎，移入干燥器备用。准确称取2 g冻干粉末样品，置于圆底烧瓶中，加入80%的乙醇溶液，超声辅助提取50 min (130 W/65℃)。提取液离心(转速10,000 r/min，4℃)后去沉淀，上清液于50℃旋蒸除去乙醇，冻干。分光光度法是通过测定显色反应达到平衡后溶液的吸光度来计算溶液的浓度。制作芦丁标准曲线，用最小二乘法求出回归方程。用同样的方法测定降糖辣椒黄酮提取液的吸光值，代入回归方程中，即可求出样品的总黄酮含量 [11] 。
2) 多酚类化合物
多酚广泛存在于天然植物的根、茎、叶、花、果实及果皮中，具有药用保健功能。杨成峻等 [12] 表明花椒多酚类物质已经被证明具有抗氧化、抑菌、镇痛抗炎、降血脂和降血糖等活性。在抗氧化方面，张正海等 [13] 表明多酚类化合物具有清除自由基的作用。陈旭等 [14] 的研究表明，山楂叶多酚对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有较好的抑制作用。
参考李勇等辣椒叶多酚提取工艺研究 [15] ，取2.000 g辣椒冻干粉，以60%乙醇作溶剂，在45℃条件下，料液比1:30 g/mL，提取40 min，pH为1，超声功率200 W。减压过滤浸提液，旋蒸浓缩至无酒精味。将产物冻干，得到辣椒多酚粗提物。制作标准曲线，用最小二乘法求出回归方程。同样的方法测定其降糖辣椒多酚粗提物的吸光值，代入上述没食子酸的回归方程中，计算提取率。
3) 多糖类化合物
多糖是一种高分子碳水化合物，它是一类具有复杂结构的糖类物质。国内外的专家学者发现天然植物多糖降血糖的机理主要有促进胰岛素的分泌、提高胰岛素的敏感性、改善糖代谢、抑制脂质氧化、抑制α-葡萄糖苷酶等生理活性 [16] [17] [18] 。李攀攀等 [19] 研究发现都匀毛尖茶多糖对四氧嘧啶模型小鼠具有明显的降糖作用，对糖尿病小鼠的糖耐量有明显的改善作用，并能改善糖代谢，增加胰岛素的分泌和肝糖原含量，同时可以降低模型小鼠血清中MDA含量，提高其SOD活力，能明显改善高血糖小鼠的脂质过氧化程度。
称量辣椒冻干粉末2.000 g，加入蒸馏水，在恒定温度下，多次提取，将复提后的滤液合并，用减压旋转蒸发仪旋蒸浓缩体积，将不同条件下提取的溶液浓缩到相同的体积。加入四倍体积的无水乙醇进行醇沉多糖，密封放入4℃冰箱内，静置12 h后，离心去上清液，将沉淀冷冻干燥后，进行称量，计算粗多糖的提取率。用苯酚–浓硫酸法对辣椒水提醇沉物中的多糖成分进行定量。
4) 辣椒渣蛋白
蛋白提取工艺采用碱提酸沉法 [20] ，超声时间102 min，超声温度56℃，碱液浓度0.4 mol/L，料液比1:27 (m:V)的条件进行重复性试验，平行5次，得到平均提取率为86.81%，最优等电点为3.6。
2.2.2. 测定降糖辣椒粗提物体外α-葡萄糖苷酶抑制率
本课题用PNPG法研究了降糖辣椒粗提物功能因子对猪小肠来源的α-葡萄糖苷酶抑制率。取降糖辣椒活性功能因子粗提物，用PBS缓冲液(pH 7.0)稀释成1 mg/mL，取30 μL置于96孔板中，加入酶液(1U∙mL−1) 50 μL，37℃培养10 min，然后加入3 mmo/L PNPG底物50 μL，混合液在37℃条件下反应20 min后，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100 μL终止反应，在SUNRISE酶标仪上设定波长为405 nm，测定吸光值。实验组与空白组试剂添加量如表1所示。
Table 1. In vitro α-glucosidase inhibition experiment
表1. 体外α-葡萄糖苷酶抑制实验
计算公式为：
2.2.3. 不同浓度辣椒黄酮对秀丽隐杆线虫体内过氧化氢酶(CAT)影响的测定
根据CAT试剂盒说明书操作，按照1:10 (m/v)加入提取液后使用组织研磨器冰浴研磨至匀浆，8000 g，4℃离心10 min，取25℃预热的工作液1 mL，加入上清液35 µL，混匀立马测其在波长240 nm处吸光值和1 min后吸光值，记为A1和A2。以每克虫体在反应体系中每分钟催化1微摩尔过氧化氢降解为一个酶活单位。
2.2.4. 辣椒多糖对线虫寿命影响
分组给药：将同步化得到的L2秀隐杆线虫随机分成6组，分别为空白组(0 μL)和辣椒多糖给药组(50、100、500、1000 μL)，每组设有1板且每板各分配30条活跃状态相当的秀丽隐杆线虫，并记为第一天，后在酒精灯旁按每组的不同体积用移液枪进行给药。给药后，置于20℃培养箱中培养。每天同一时间将存活的线虫转移至新平板中，记录每天存活的线虫数，直至全部死亡，线虫死亡标准为铂金铲触硬线虫无任何反应，丢失和爬到培养基壁上干死的线虫应从统计中剔除。
2.2.5. 辣椒多糖添加量对秀丽隐杆线虫运动能力的影响
将不同浓度辣椒多糖暴露5天后的线虫转移至NGM培养基上，恢复适当时间，使用显微镜观察线虫头部在1分钟内摆动的次数。每个处理组统计30条线虫。线虫摄食能力的强弱可以通过咽部抽动速率来体现。将不同浓度辣椒多糖暴露5天后的线虫转移至铺有OP50的NGM上，先让其爬行30 min，再直接在荧光显微镜底下计数线虫60 s内咽部抽动的次数，每组测定30条线虫。数据统计分析与作图主要通过软件spass26完成，所有实验结果均表示为平均值 ± 标准误(Means ± SEM)。
3. 结果与分析
3.1功能活性因子的含量测定
总黄酮含量如下计算
根据实验方法所测得的降糖辣椒粗黄酮溶液吸光度带入线性方程y = 0.8689x + 0.0083 (R2 = 0.9981)，计算出相对应浓度为0.891 mg/mL。根据公式计算出所得样品中降糖辣椒粗黄酮含量为27.365 mg/g。
多糖含量(%) = (A − B) × V × D/(C × W)
根据实验方法所测得的降糖辣椒粗多糖溶液吸光度带入线性方程y = 0.0567x + 0.0564 (R2 = 0.9905)，计算出相对应浓度为3.66 μg/mL。根据公式计算出所得样品中降糖辣椒粗多糖提取率为91.04%。
多酚含量(%) = (A − B) × V × D/(C × W)
根据实验方法所测得的降糖辣椒粗多酚溶液吸光度带入线性方程y = 81.695x + 0.0205 (R2 = 0.9913)，计算出相对应浓度为0.004584 mg/mL，根据公式计算出所得样品中降糖辣椒粗多酚提取率为11.46%。
3.2. 降糖辣椒功能活性因子提物体外α-葡萄糖苷酶抑制率
Figure 1. Functional activity factors affecting α-glucosidase inhibition rate: (a) Flavonoids; (b) Polyphenols; (c) Polysaccharides; (d) Protein
图1. 功能活性因子对α-葡萄糖苷酶抑制率：(a) 黄酮；(b) 多酚；(c) 多糖；(d) 蛋白质
降糖辣椒黄酮类化合物对于α-葡萄糖苷酶体外抑制的作用较为明显，1.982 mg/mL的抑制率达到了70%，辣椒多糖提取物0.1 mg/mL、0.2 mg/mL的抑制率均在80%以上，辣椒多酚提取物1.738 mg/mL、2.172 mg/mL的抑制率均在40%以上，如图1所示。因此可以得出结论，降糖辣椒中的多糖和黄酮是主要的α-葡萄糖苷酶抑制活性因子。
3.3. 不同浓度辣椒提取物对秀丽隐杆线虫体内过氧化氢酶(CAT)活力影响的测定
Figure 2. Determination of the effect of chili flavonoids on the activity of catalase (CAT) in the body of Caenorhabditis elegans: (a) Flavonoids; (b) Polyphenols; (c) Polysaccharides; (d) Protein
图2. 辣椒黄酮对秀丽隐杆线虫体内过氧化氢酶(CAT)活力影响的测定：(a) 黄酮；(b) 多酚；(c) 多糖；(d) 蛋白质
如图2经过高浓度辣椒处理后的线虫体内CAT酶活力显著升高，其中2 mg/mL辣椒多糖处理的线虫酶活提高明显，说明其体内羟基自由基清除能力显著提高，有良好的抗氧化效果。
3.4. 辣椒多糖对线虫寿命影响
Figure 3. The effect of chili polysaccharides on the lifespan of nematodes
图3. 辣椒多糖对线虫寿命的影响
如图3将辣椒多糖以不同添加量对秀丽隐杆线虫进行饲喂，探究对线虫的延寿作用，确定其有效添加浓度。结果显示，当添加辣椒多糖能显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，其中500 μL组中位平均寿命增加4 d，约延长了21.05%，最大寿命增加2 d。辣椒多糖具有显著延长秀丽隐杆线虫的寿命的能力，且呈现一定范围的浓度梯度依赖性。
3.5. 辣椒多糖添加量对秀丽隐杆线虫运动能力(头部摆动频率和线虫吞咽频率)的影响
Table 2. Effect of chili polysaccharide addition on the motility of Caenorhabditis elegans
表2. 辣椒多糖添加量对秀丽隐杆线虫运动能力的影响
注：同列不同字母表示具有显著差异，P < 0.05
由表2可知，当辣椒多糖含量较低时，线虫运动速率与对照组相比无显著差异(P > 0.05)，表明低浓度辣椒多糖无法影响线虫的运动。当辣椒多糖含量为0.5 mg/mL时，线虫运动速率显著高于对照组(P < 0.05)和1 mg/mL实验组(P < 0.05)；但是0.1 mg/mL实验组与0.5 mg/mL实验组无显著差异(P > 0.05)。当辣椒多糖含量为1 mg/mL时，相比空白对照组的101.00 ± 5.78次/min.增加了47.52%；运动频率达到了149.00 ± 7.25次/min。
当辣椒多糖含量为1 mg/mL时，相比空白对照组的200.00 ± 0.82次/min，增加了50.00%；运动频率达到了300.00 ± 1.63次/min。说明辣椒多糖具有显著提高秀丽隐杆线虫的吞咽的能力。
4. 讨论
基于国内外同类工作研究现状和本课题组研究基础，本研究以现有的辣椒部分高代材料为初始研究对象，针对它们所含有的主要功能因子：蛋白质、多酚、黄酮、多糖等，通过高效绿色的提取和纯化技术进行集成制备并对其有效成分进行分析检测，在获得相关成熟技术和工艺的基础上，通过构建秀丽隐杆线虫不同模型进行功效验证。植物中活性成分分布广泛，种类繁多，作用机制也各不相同，通过体外抗氧化测评，高浓度辣椒提取物可以很好清除体外游离总自由基和游离羟基自由基，有良好抗氧化作用。通过对秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶活力的测定，证实辣椒提取物可以提高生物体内有清除自由基效果的酶活力，在高浓度给药的情况下，秀丽隐杆线虫体CAT酶活力显著提高，证明其在机体内有提高抗氧化酶活力的能力，可以进一步证明其的抗氧化能力。