摘要: 目的：应用网络药理学和分子对接方法深入研究清眩润目饮治疗干眼症(Dry Eye Disease, DED)的作用机制。方法：首先，利用TCMSP、UniProt数据库收集清眩润目饮的活性成分及相关靶点，通过Cytoscape 3.9.1软件进行可视化，检索GeneCards与OMIM数据库获取DED的相关靶点。然后，借助venny 2.1平台绘制韦恩图，利用STRING平台构建蛋白相互作用(PPI)网络，并用Cytoscape进行可视化分析。将靶点信息导入Metascape数据库，进行后续的GO功能和KEGG通路富集分析，通过微生信平台进行可视化。最后使用AutoDock进行分子对接。结果：共获得清眩润目饮活性成分204个，对应靶点574个，DED相关靶点2621个，得到294个交集靶点；网络分析的结果显示TNF、IL-6、TP53、JUN、STAT3和AKT1为清眩润目饮治疗DED的核心靶点，槲皮素、山柰酚、木犀草素、维生素和腺苷为关键活性成分。共富集得到827条GO条目，154条KEGG通路。分子对接结果表明2种核心活性成分与TP53和AKT1均有较好结合活性。结论：清眩润目饮可能通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、维生素和腺苷等核心活性成分作用于TP53、AKT1等核心靶点治疗DED，为清眩润目饮治疗DED提供理论依据。
Abstract:
Objective: To explore the mechanism of Qingxuan Runmu Decoction in the treatment of Dry Eye Disease (DED) by network pharmacology and molecular docking methods. Methods: Firstly, TCMSP and UniProt databases were used to collect the active ingredients and related targets of Qingxuan Runmu Decoction, and Cytoscape 3.9.1 software was used for visualization. GeneCards and OMIM databases were used to obtain the related targets of DED. Then, venny 2.1 platform was used to draw Venn diagram, STRING platform was used to construct protein-protein interaction (PPI) network, and Cytoscape was used for visual analysis. The target information was imported into the Metascape database for subsequent GO function and KEGG pathway enrichment analysis, which was visualized through the WeChat platform. Finally, AutoDock was used for molecular docking. Results: A total of 204 active ingredients of Qingxuan Runmu Decoction were obtained, with 574 corresponding targets, and 2621 DED related targets were obtained, with 294 intersection targets. The results of network analysis showed that TNF, IL-6, TP53, JUN, STAT3 and AKT1 were the core targets of Qingxuan Runmu Decoction in the treatment of DED, and quercetin, kaempferol, luteolin, vitamin and adenosine were the key active components. A total of 827 GO entries and 154 KEGG pathways were enriched. Molecular docking results showed that the two core active components had good binding activities with TP53 and AKT1. Conclusion: Qingxuan Runmu Decoction may treat DED by acting on the core targets such as TP53 and AKT1 through the core active components such as quercetin, kaempferol, luteolin, vitamin and adenosine, which provides a theoretical basis for the treatment of DED.
1. 引言
2020年《中国干眼专家共识》 [1] 中将DED定义为一种眼表的慢性疾病，其主要表现为泪膜稳定性差或失去平衡状态的眼表微环境，伴随局部的慢性炎症、组织及神经性的损伤。此病为患者带来多种眼部主观症状，如眼涩、畏光、眼部瘙痒、刺痛感及沙砾感、视疲劳、烧灼感和视物模糊等，角结膜干燥，甚至溃疡等严重后果也时有发生，对患者生活质量造成严重影响。据流行病学调查显示，亚洲地区的干眼患病率全球最高 [2] ，女性患者数量明显多于男性。老年，吸烟，熬夜和缺乏锻炼均为DED的危险因素 [3] 。目前临床的常用药物主要是环孢素、玻璃酸钠、普拉洛芬及氟米龙等西药 [4] [5] ，可快速改善局部症状，但效果短且长期应用可能会引起一系列并发症，如眼痛、刺激感及眼压升高等表现 [6] [7] ，而中医讲究整体观念，中医药具有据法选方、合理搭配、高安全性和价格低廉的特色优势，治疗效果更为持久，且不良反应较少，值得临床应用。
清眩润目饮是一款由多种成分组成的复合中药颗粒，其主要成分包括白术、桔梗、玄参、甘草、金银花、连翘、生地黄、防风和麦冬 [8] 。清眩润目饮目前已应用于包括自身免疫性干眼症 [9] 、睑板腺功能障碍致蒸发过强型干眼症 [10] 、水液缺乏型干眼症 [11] 和术后干眼症 [12] 等类型干眼症的临床治疗，临床表现优异，能明显的改善睑板腺功能并减轻炎症反应。有研究表明，清眩润目饮治疗后，明显下调泪液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平 [8] [13] ，但其具体的分子机制尚不明确，为了更加深入了解清眩润目饮治疗DED的作用机制，通过网络药理学，我们成功构建了“化合物–蛋白质/基因–疾病”网络，以高通量方法揭示了小分子的调控机制 [14] 。进一步探讨了清眩润目饮在治疗DED病方面的分子机制与疗效，为临床治疗提供了新的研究方向。
2. 材料与方法
2.1. 清眩润目饮的活性成分及靶点
我们在TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和BATMAN-TEM数据库 (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中对清眩润目饮的活性成分及可能与活性成分相关的靶点进行了检索，检索的中药成分有白术、麦冬、玄参、生地黄、金银花、连翘、防风、桔梗和甘草。检索UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中所有靶点蛋白的官方名称，并限定靶点物种为Human。
2.2. Dry Eye Disease相关靶点预测
我们以“Dry Eye Disease”为关键词，经在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man, OMIM)和人类基因数据库(the human gene database, GeneCards)获取DED基因，将重复基因进行筛选并剔除，收集DED靶点。
2.3. 获取交集靶点并绘制韦恩图
将检索获得的清眩润目饮的药物活性成分的相关靶点与DED疾病靶点进行交叉对比，使用venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘图软件构建成分靶点与疾病靶点的韦恩图，图中交汇部分即为交集靶点，其包含了清眩润目饮活性成分中可能与DED相关的所有基因靶点。
2.4. 药物–活性成分–作用靶点–疾病网络图
利用Cytoscape 3.9.1构建清眩润目饮–活性成分–作用靶点-DED网络图，图中的节点(Node)分别代表清眩润目饮的活性成分、DED及二者的交集靶点，各节点之间则由边(Edge)来绘制其关联性。
2.5. PPI网络构建
基于清眩润目饮的潜在靶点与DED靶点的匹配结果，通过STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络，分析这些靶点之间的相互作用。设置物种为“Homo sapiens (人)”，并将最高相互作用评分设置为“Highest Confidence (最高等置信度)”，其余参数保持默认设置，剔除独立节点后，利用Cytoscape 3.9.1绘图，得到蛋白的相互作用关系，并探索关键靶蛋白。
2.6. GO和KEGG富集分析
通过Metascape (http://metascape.org/)数据库对清眩润目饮治疗DED的关键靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，对其通路信息、分子功能、细胞化合物和生物过程进行分布检验，以P < 0.05为基准对结果进行可视化分析，并经微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)制作柱状图。
2.7. 分子对接
利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得活性成分化合物，并通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取核心靶点蛋白，将配体及溶剂使用AutoDock软件去除，添加极性氢离子并进行分子对接，从而明确清眩润目饮中有效成分与核心靶点间的结合和相互作用程度，最后使用PyMoL软件进行可视化。
3. 结果
3.1. 清眩润目饮的活性成分和成分–靶点网络
把口服生物利用度(OB) ≥ 30%及类药性(DL) ≥ 0.18作为条件，筛选出清眩润目饮的活性成分，分别得到白术55种、玄参5种、金银花17种、连翘19种、防风18种、桔梗4种以及甘草88种。麦冬及生地黄活性成分的检索则依靠BATMAN-TEM数据库进行，设定Score > 0.84 (LR = 80.88)，P < 0.05后筛出41种麦冬相关活性成分，27种生地黄相关活性成分。归纳所有活性成分后去除重复部分，获得204种清眩润目饮的有效成分，并利用UniProt数据库对204种活性成分进行对应靶点基因检索，再次去重，共得到574个靶基因。
3.2. 药物–疾病靶点韦恩图
限定相关性评分大于10后，运用GeneCards获取2141个相关靶点，OMIM数据库获取567个DED相关靶点，将重复靶点去除后，能够获得2621个靶点。将清眩润目饮药物靶点与疾病靶点绘制韦恩图后交集出294个药物–疾病靶点(图1)。
注：左边圆圈为与DED相关的作用靶点，右边圆圈代表与清眩润目饮相关的作用靶点，交集处代表二者的关联靶点。
Figure 1. Intersection target map of Qingxuan Runmu Decoction and DED
图1. 清眩润目饮与DED的交集靶点图
3.3. “清眩润目饮–活性成分–交集靶点-DED”网络图
利用Cytoscape软件构建“清眩润目饮–活性成分–交集靶点-DED”网络图(图2)，该网络包含497个节点，2553条边。通过CytoNCA插件进行拓扑分析，得到度值排名前5的关键活性成分：木犀草素(luteolin)、维生素D3 (Vitamin D3)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)和腺苷(Adenosine)。
3.4. PPI网络
在STRING 中将清眩润目饮与DED靶点的交集蛋白构建为如图3所示的PPI网络，得到TSV文件后，由Cytoscape 3.9.1进行可视化分析(图4)。以度值 ≥ 20界定关键靶点，再次进行拓扑分析，得到23个“节点”即交集蛋白，114条“边”即蛋白间的关联作用，得到前6名的度值排名包括有：STAT3、TP53、IL-6、TNF、AKT1和JUN。
Figure 2. Qingxuan Runmu Decoction drug active ingredient-intersection target-DED
图2. 清眩润目饮药物活性成分–交集靶点-DED
Figure 3. PPI network of Qingxuan Runmu Decoction in treating DED
图3. 清眩润目饮治疗DED的PPI网络
Figure 4. Visual analysis of active constituents and shared targets
图4. 活性成分与共有靶点可视化分析
3.5. GO富集分析结果
我们利用Metascape数据库检索，最终得出PPI核心靶点中827个生物过程，30个细胞组分以及43个分子功能，限定-log10(P)值为Enrichment score，排序后，分别绘制排名前10的柱状图(见图5)。GO功能富集的分析结果可由图中看出，核心靶点主要涉及细胞对细胞因子作出的反应、胶质细胞再生、刺激细胞迁移等生物过程，而其主要分布在膜筏、膜微区、转录调节因子复合物等微小结构，其主要分子功能涵盖了线粒体一氧化氮合酶调节活性、磷酸酶及蛋白激酶结合活性等。
注：BP：生物过程，CC：分布区域，MF：分子功能。
Figure 5. GO enrichment analysis
图5. GO富集分析
3.6. KEGG通路分析结果
在进行KEGG通路分析时，我们采用了Metascape数据库对PPI网络的核心靶点进行查找，设定P < 0.05，并按照Count值及P值进行排序，得到的154条通路中只将前20条通路进行柱状图展示(图6)。由图中结果可以得出，清眩润目饮能起到治疗DED的作用，与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、人乳头瘤病毒感染、MAPK信号通路及癌症中的通路等相关。
3.7. 分子对接结果分析
我们选取TCMSP中获得的清眩润目饮中度值最高的前2种共同生物活性成分，分别是槲皮素(quercetin)和维生素D3 (Vitamin D3)，将其二者分别与PPI蛋白互作中最重要的核心靶点TP53和AKT1进行分子对接。可以见到不论是槲皮素还是维生素D均展现出了好的结合活性(表1)，通过PyMoL软件可视化其对接关系，结果见图7。
注：(a) 槲皮素-TP53；(b) 槲皮素-AKT1；(c) 维生素D-TP53；(d) 维生素D-AKT1。
Figure 7. Analysis of molecular docking results
图7. 分子对接结果分析
4. 讨论
大多数干眼患者都能获得良好的最佳矫正视力，除了晚期或严重病例外，使用常规视力测量很难检测到视力下降，这使得患者对此种疾病的警惕性明显下降，但干眼带来的痛苦却很多，包括但不限于眼部干涩、异物感、疲劳感、刺痛、畏光和灼热感等 [15] ，严重影响患者的生活质量。DED属于典型的多因素疾病，目前没有十分明确的发病机制，大多数与泪腺的慢性炎症相关，在眼表产生炎性细胞因子和趋化因子等，使眼表感觉神经的活动减弱，从而使泪液的分泌减弱，进而引发泪膜完整性破坏和功能障碍 [16] 。因而，根据DED的多个发病机制，寻找能同时起效的药物是十分必要的。
清眩润目饮是由我国医师以增液汤为基础随证加减而创，已被应用于多种类型干眼，包括：水液缺乏型、蒸发过强型及肺阴不足型等 [11] [17] [18] ，主要成分白术、甘草、玄参、麦冬、桔梗、生地黄、防风、金银花和连翘、防风，多味合用，既能健脾生津润肺养阴，肺脾同治，又能除湿解毒清热祛风，是临床治疗DED的有效方剂。但目前暂无清眩润目饮方剂治疗DED的机制研究，故本文章基于网络药理学方法研究清眩润目饮治疗DED的作用机制，筛选出活性成分和核心靶点，并进一步得到涉及到的相关通路。发现清眩润目饮治疗DED的主要活性成分为槲皮素和维生素D，核心靶点为TP53和AKT1，涉及了多条通路：PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和IL-17信号通路等。
多项研究表明，槲皮素可以降低泪液IL-1α浓度，降低CD4+ T细胞水平，展现出优秀的抗氧化和抗炎特性 [19] [20] 。全身性的补充维生素D作为常规DED治疗的辅助剂明显改善了泪液稳定性和泪液渗透压 [21] 。此前还有研究观察到，DED患者泪液中IL-6、IL-17和TNF-α水平明显高于对照组，抗IL-17治疗抑制了DED症诱导的角结膜杯状细胞丢失以及角膜血管化、混浊和老化溃疡等 [22] [23] 。除此之外，Han等人发现抑制PI3K/AKT/NF-κB和MAPK通路对DED症具有治疗作用，能明显降低结膜炎症因子和CD4+T细胞浸润，还可避免严重的细胞凋亡和降低MMP-3和MMP-9的水平来保护眼表 [24] 。Ma等人发现DED时抑制人角膜上皮细胞中MAPK、p38和JNK的磷酸化，可进一步抑制促炎细胞因子的水平，包括IL-6、IL-17、TNF-α和IL-1β等 [25] 。Zhu等学者的研究结果表明，PI3K-Akt通路增强的小鼠，表现出炎症性病理变化和功能受损，易出现DED样症状，如角膜角化、角膜细胞凋亡和泪液减少 [26] 。
综上所述，清眩润目饮从多成分、多通路调控DED，体现中医药防治疾病的整体观念和辩证论治指导思想，为明确清眩润目饮治疗DED的作用机制提供了重要依据，为中医药治疗DED方面提供了新思路。但本研究也存在一些缺陷，仅从理论水平上探讨清眩润目饮的作用机制，下一步将通过实验进一步验证，以此提供一定的科学支持。
NOTES
*通讯作者。