1. 引言
大果木姜子为米槁(Cinnamomum migao H. W. Li)的干燥成熟果实,属樟科樟属植物,主要分布于贵州、云南、广西等省 [1] 。大果木姜子作为药食两用植物具有温中散寒、理气止痛等功效,临床上主要用于冠心病、心绞痛等心血管疾病及胃肠道疾病的治疗,且具有极好的抗氧化作用 [2] 。以大果木姜子为原料开发出米稿心乐滴丸、理气活血滴丸、米稿精油滴丸、心胃丹胶囊等制剂 [3] 。在体外抑菌实验中发现,大果木姜子挥发油对幽门螺杆菌有较强的抑制作用。在民间,大果木姜子常作为调味品使用,起健脾开胃的效果。大果木姜子挥发油为其主要药效及食用部位,主要含有单萜类,倍半萜类物质,如桉油精、香桧烯、(−)-β-蒎烯、(+)-α-蒎烯、(−)-α-蒎烯、β-石竹烯、δ-杜松烯等。此外,还有酮类、芳香烃类及环氧化合物 [4] 。目前,大果木姜子野生资源日渐枯竭,对其萜类物质合成途径中关键酶基因的挖掘研究具有重要意义。
萜类化合物具有多种生理和生化活性,在植物适应环境、抵御天敌、传递信号等方面发挥重要的作用,可作为天然植物源农药的重要来源。青蒿素、紫杉醇、植物甾醇等萜类物质都对不同病症具有显著疗效 [5] 。萜类化合物由单个或多个异戊二烯单元组成,其合成途径主要分为三步:首先,合成异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基二磷脂(DMAPP)前体物质;而后,合成牦牛儿基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牦牛儿牦牛儿基焦磷酸(GGPP)等。最后,通过不同的酶合成丰富多样的萜类化合物并进行修饰 [6] 。萜类合酶是萜类化合物合成的关键酶,已在多种植物中被克隆出来,如雷公藤TwMTS能催化GPP生成β-香茅醇,结球甘蓝BoGES以GGPP为底物生成香叶基芳樟醇,樟树中存在大量的TPS基因,可催化GPP生成冰片基焦磷酸、芳樟醇和1,8-桉叶油,还可与FPP反应生成橙花叔醇 [7] [8] [9] 。本课题组前期测得大果木姜子转录组数据,在此实验基础上,从大果木姜子中克隆到一个萜类合酶基因LlTPS11,对其进行生物信息学分析,以期为解析大果木姜子中萜烯类物质的生物合成机制提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
大果木姜子采自贵州省罗甸县,Jm109感受态由本实验室自行保存。植物RNA提取试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司,pMD18-T、BamH I、Hind III限制性核酸内切酶及PrimeScript™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购于宝日医生物技术(北京)有限公司,琼脂糖、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司购于生工生物工程(上海)股份有限公司,基因克隆引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。
2.2. 方法
2.2.1. RNA提取及cDNA 合成
取约50~100 mg大果木姜子,在液氮中将其研磨粉碎,利用植物RNA提取试剂盒提取大果木姜子总RNA,用超微量紫外分光光度计检测其浓度。利用PrimeScript™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将所提取的大果木姜子总RNA反转录成cDNA,测定浓度,−20℃冻存备用。
2.2.2. LlTPS11基因克隆
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. Primers sequence used in this study
表1. 引物序列
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. PCR amplification program
表2. PCR扩增程序
使用Primer 5软件对LlTPS11基因序列分析,设计基因特异性引物(表1)。以反转录得到的cDNA为模板进行按表2中PCR程序扩增,用1%的琼脂糖凝胶电泳初步判断目的基因条带,利用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段,经B500超微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度后,与pMD18-T 16℃连接16 h,次日转入Jm109感受态细胞中。挑取单克隆进行菌液PCR验证,并进行BamH I、Hind III双酶切鉴定,重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,运用DNAMAN将测序拼接结果与转录组数据进行比对。
2.2.3. LlTPS11生物信息学分析
利用表3中生物信息学软件对LlTPS11蛋白序列的开放阅读框、相对分子质量、氨基酸序列、等电点、不稳定系数、亲水性等理化性质,以及蛋白质二级、三级结构进行分析,
通过NCBI选择不同植物的TPS序列,利用DNAMAN进行多序列分析,并利用MEGA7.0软件采用邻接法(NJ)构建LlTPS11的分子进化树。
3. 结果与分析
3.1. LlTPS11全长CDS序列克隆
以大果木姜子cDNA为模板,用设计的引物进行扩增,获得一条约为1600 bp大小的条带(如图1)。将PCR产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,回收产物与pMD18-T连接,而后转入Jm109感受态,得到重组质粒。重组质粒进行酶切验证后送生工生物有限公司测序,测序结果与转录组序列比对完全一致(如图2)。NCBI OFR分析表明LlTPS11的全长开放阅读框为1692 bp,共编码563个氨基酸。
注:M:DL2000 DNA Maker;1~2:PCR产物
注:LlTPS11-1:拼接结果;LlTPS11-zhuan:转录组序列
3.2. LlTPS11蛋白理化性质
使用Expasy在线分析软件对LlTPS11序列分析,结果显示该基因编码的蛋白质大小为65.41 kDa,带负电荷的残基85,带正电荷的残基65,分子式为C2947H4608N770O868S22,理论等电点为5.29,不稳定指数为42.36,属不稳定蛋白。脂肪指数为96.32。ProtParam结果显示LlTPS11蛋白亲水性总平均值为−0.324,亲水亲油平衡值最低为−3.0,在115号位,亲水亲油平衡值最高为2.6,在424号位,为亲水性蛋白(图3)。
![](//html.hanspub.org/file/7-2360879x10_hanspub.png?20240328090039831)
Figure 3. Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of LlTPS11 amino acid
图3. LlTPS11氨基酸亲疏水预测
3.3. LlTPS11蛋白的信号肽、蛋白结构域预测
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Figure 4. Signal peptide prediction of LlTPS11 protein
图4. LlTPS11 蛋白的信号肽预测
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Figure 5. Domain analysis of LlTPS11 protein
图5. LlTPS11结构域分析
信号肽是蛋白质N-末端一段编码长度为5~30的疏水性氨基酸序列,存在于分泌蛋白、跨膜蛋白和真核生物细胞器内的蛋白中。使用SignalP-5.0预测LlTPS11的信号肽位置,分析结果显示,有信号肽的概率为0.077%,没有信号肽结构,属于非分泌蛋白(图4)。使用在线工具NCBI CD-Search预测LlTPS11蛋白结构域,结果显示其含有Terpene_cyclase_plant_C1保守结构域,属于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族(图5)。
3.4. LlTPS11跨膜结构及亚细胞定位预测
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Figure 6. Transmembrane domain prediction of LlTPS11 protein
图6. LlTPS11跨膜区域预测
用TMHMM在线软件分析预测LlTPS11的跨膜结构域,结果显示该蛋白肽链上无跨膜结构域,表明该蛋白属于非跨膜蛋白(图6)。利用Softberry分析预测StGID1的亚细胞定位(图7),结果显示,该蛋白质有较大可能位于细胞质、叶绿体内。
![](//html.hanspub.org/file/7-2360879x14_hanspub.png?20240328090039831)
Figure 7. Prediction of LlTPS11 subcellular location
图7. LlTPS11亚细胞定位预测
3.5. LlTPS11蛋白的二级、三级结构预测
SOPMA在线网站显示LlTPS11蛋白的二级结构包含67.32% α-螺旋、4.97%延伸链、3.20% β转角、24.51%无规卷曲(图8(A))。利用在线软件SWISS-MODEL对其三级结构进行预测,结果显示LlTPS11与沉水樟CmTPS (Cinnamomum micranthum f. kanehirae)相似度达70.59%,GMQE为0.91 (图8(B)),与二级结构预测结果一致。
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Figure 8. Prediction of the structure of LlTPS11 protein
图8. LlTPS11蛋白结构预测
3.6. LlTPS11多序列比对及系统进化树构建
将LlTPS11与已报道的大豆(Glycine max, XP_04086321.1, XP_014617595.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_001190374.1)、樟树(Cinnamomum micranthum, RWR94587.1)、玉兰(Magnolia sinica, XP_058104887.1)中TPS家族蛋白序列进行多序列比对,发现LlTPS11及其同源蛋白序列N端均具有保守结构域,富含天冬氨酸的DDxx D基序和NSE/DTE基序(红色方框),表明LlTPS11为I类TPS家族成员(图9)。
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Figure 9. Comparison of TPS amino acid sequences of plants
图9. 多种植物TPS氨基酸序列对比
将LlTPS11与其他植物中已报道的不同亚型的TPS蛋白构建系统进化树,结果表明,LlTPS11与沉水樟(Cinnamomum micranthum)、月桂(Laurus nobilis L.)、红球姜(Zingiber zerumbet)及姜(Zingiber officinale)聚为一支,且与沉水樟关系最近,属TPSa亚家族(图10)。
4. 讨论
现代药理研究表明,大果木姜子挥发油具有抗氧化 [10] 、抗病毒 [11] 、抗炎镇痛 [10] 、抑菌 [12] 等作用,且对心血管系统有一定影响 [13] 。中草药萜烯类化合物多被应用于医药、化妆品、香料、生物燃料及杀虫剂等领域 [14] 。大果木姜子研究主要集中于化学成分、药理药效以及产业化发展等方面,而关于大果木姜子萜类合酶研究鲜有报道 [15] 。
萜类化合物是一类生物自身产生的种类丰富、结构复杂的天然产物家族 [16] 。大果木姜子的风味及功效是由其挥发性萜类化合物决定的,萜类化合物具有多种生理和生化活性,主要为单萜、倍半萜及衍生物,如1,8-桉叶素、α-水芹烯、龙脑、D-柠檬烯和α-松油醇等。单萜类化包含两个异戊二烯单元,根据化学结构可分为环状单萜以及非环形或线形单萜,经不同的单萜合成酶催化香叶基二磷酸酯可生成了不同的单萜。倍半萜是则是由倍半萜合成酶催化法尼基二磷酸酯环化反应而成,紫穗槐-4,11-二烯合成酶(ADS)是倍半萜物质青蒿素生物合成途径中关键限速酶 [17] 。萜类化合物的多样性主要是因为萜类合酶(Terpenoid synthetase, TPS)催化前体物质的环化模式不同,其中催化单萜和倍半萜类生物合成关键酶主要为TPS-a、TPS-b、TPS-g亚家族。目前已从紫丁香 [18] 、温郁金 [19] 、深纹核桃 [20] 等植物中克隆出了TPS基因。
本文克隆得到大果木姜子萜类合酶基因(LlTPS11),并对LlTPS11蛋白序列的理化性质、信号肽、亚细胞定位和亲疏水性等进行分析。分析表明,大果木姜子的LlTPS11基因完整开放阅读框全长1698 bp,共编码563个氨基酸,蛋白分子质量为65.41 kDa,理论等电点5.29。此外,LlTPS11脂肪系数为96.32,不稳定指数为42.36,大于40,则LlTPS11为不稳定蛋白。疏水性预测显示,LlTPS11平均疏水性为−0.324,亲水的蛋白。结合信号肽和跨膜结构域预测分析,该蛋白是一种不稳定的、非跨膜的蛋白。亚细胞定位可将某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置,如细胞核内、各种细胞器以及质膜上,从而为理解基因的作用机制提供研究方向。亚细胞定位分析表明,LlTPS11蛋白最有可能存在于细胞质或叶绿体中。因此,可推断该蛋白在细胞质和叶绿体上发挥作用,进一步调控萜类化合物的合成与积累。结果显示其含有植物萜烯环化酶保守结构域,属于类异戊二烯生物合成酶超家族。蛋白比对显示,LlTPS11肽链N端富含天冬氨酸DDxxD基序和NSE/DTE基序。同时,对大果木姜子的LlTPS11进行系统进化树的构建,发现其TPS-a亚家族具在一起,与沉水樟CmTPS亲缘关系较近高。然而,它是否具有合成单萜和倍半萜功能还需进一步研究。
综上所述,本研究可加强对大果木姜子萜类物质调控机制的认识,特别是萜类合酶的调控,进而为从分子水平增加萜类化合物的种类和含量,并达到改善大果木姜子香味或预功效目的。后期将通过转基因及体外酶活实验对LlTPS11蛋白在体内、体外功能上进行深入研究。
5. 结论
本文克隆到大果木姜子LlTPS11基因,开放阅读框全长1698 bp,共编码563个氨基酸,生物信息学分析表明LlTPS11为不稳定的、亲水性的、非跨膜的蛋白,可能定位于细胞质、叶绿体内。LlTPS11肽链N端富含天冬氨酸DDxxD基序和NSE/DTE基序,属于类异戊二烯生物合成酶家族。大果木姜子LlTPS11进行系统进化树的构建,发现其TPS-a亚家族聚在一起,与沉水樟CmTPS亲缘关系较近高。
基金项目
本研究由贵中医大创合字(2021) 36号、贵州省科技厅基础研究项目(黔科合基础[2019]1019号)和贵州省“千层次”人才项目(贵中医[ZQ2018004])共同资助。
NOTES
#第一作者。
*通讯作者。