S100A4在银屑病炎症中的机制研究

Mechanism Study of S100A4 in Psoriasis Inflammation

摘要: 目的：探究S100钙结合蛋白A4 (S100 Calcium Binding Protein A4, S100A4)在银屑病炎症中的作用机制。方法：在HaCat细胞中使用S100A4的抗体进行改进的紫外交联免疫共沉淀结合高通量测序(improved RNA Binding Protein Immunoprecipitation high throughput sequencing, iRIP-seq)技术获得与S100A4互作的RNA，将相关基因序列比对KEGG数据库来明确S100A4调控的炎症通路。结果：S100A4结合的靶RNA所在基因与MAPK信号通路、核糖体、内质网中的蛋白质加工、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、慢性髓样白血病、弓形体病、结肠直肠癌、破骨细胞分化、军团杆菌病等功能通路的调节有关，表明S100A4可能是调节银屑病及其并发症的一种关键炎症介质。结论：S100A4在银屑病炎症机制中具有潜在的调控作用，这些发现为S100A4作为银屑病发病炎症介质提供了新的证据。

Abstract: Objective: Explore the mechanism of S100 calcium binding protein A4 in psoriasis inflammation. Methods: Improved RNA Binding Protein Immunoprecipitation high throughput sequencing using S100A4 antibodies in HaCat cells was used to obtain RNA that interacts with S100A4. The relevant gene sequences were aligned with the KEGG database to identify the inflammatory pathway regu-lated by S100A4. Results: The target RNA of S100A4 is related to MAPK signaling pathway, ribo-some, protein processing in the endoplasmic reticulum, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, bladder cancer, chronic myeloid leukemia, toxoplasmosis, colorectal cancer, osteo-clast differentiation, and legionellosis, indicating that S100A4 may be a key inflammatory mediator regulating psoriasis and its complications. Conclusion: S100A4 has a potential regulatory role in the inflammatory mechanism of psoriasis, and these findings provide new evidence for S100A4 as an inflammatory mediator in the pathogenesis of psoriasis.

1. 引言

S100钙结合蛋白A4 (S100 Calcium Binding Protein A4, S100A4)，是一种低分子量钙离子结合蛋白，具有感知和响应细胞内钙浓度变化的功能，可在广泛的正常组织和细胞类型中表达 [1] [2] 。同其他S100蛋白家族成员一样，编码S100A4的基因位于1q21染色体上的银屑病易感位点内的基因中，表明S100A4与银屑病存在一定的关联 [3] 。既往研究表明，S100A4最成熟的功能是诱导和促进肿瘤的转移，但同时S100A4也是一种关键的炎症介质，在不同病理条件下诱导细胞因子和生长因子的释放，促进包括银屑病在内的多种炎症性疾病的发生 [4] 。研究发现，S100A4在银屑病患者的真皮组织中显著上调，在银屑病异种移植SCID小鼠模型中沉默S100A4后，可以观察到小鼠的表皮厚度显著减少，角质形成细胞增殖和血管化受损程度明显减轻 [5] ，提示S100A4在银屑病的发生发展中发挥了重要作用，然而目前并不清楚其中的分子机制。

银屑病是一种复发性、慢性、T细胞介导的多基因疾病，临床特征为头皮、四肢伸肌部位，特别是肘部和膝盖和腰骶区出现红色鳞状斑块 [6] 。银屑病影响着超过2%的世界人口，在中国其发病率从1984年的0.123%上升到0.47%，是全球公共卫生面临的巨大挑战 [7] 。近年来，司库奇尤单抗、依那西普、乌司奴单抗等银屑病特异蛋白分子的靶向药物在治疗中重度斑块状银屑病、难治性银屑病方面发挥了巨大的作用，但它们仍然不能完全消除这种疾病 [8] 。因此亟需更深入发现和研究银屑病的生物靶标和分子作用机理，开发出新的靶向精准治疗方案以应对银屑病治疗中的难点。

既往研究表明，S100A4是一个通过互作组捕获技术而被发现的新型RNA结合蛋白(RNA-Binding Proteins, RBP)，可能通过对转录和转录后过程的调节影响银屑病炎症相关基因的表达 [9] 。RBP是指那些能通过结合RNA来调控RNA转录及转录后的可变剪接、修饰、转运、翻译和降解代谢等关键环节，进而调控基因表达和功能的蛋白 [10] ，RBP的表达异常或功能缺失与银屑病的发生发展密切相关 [11] 。因此推测S100A4可以发挥RBP的功能来调控基因表达，进而影响银屑病的发生和发展，其中确定S100A4的结合靶点至关重要。故本研究通过改进的RNA免疫沉淀和高通量测序技术(improved RNA Binding Protein Immunoprecipitation high throughput sequencing, iRIP-seq)在人永生化角质形成细胞(HaCat细胞)中鉴定S100A4调控的基因及炎症通路，对S100A4直接作用的靶标及炎症通路进行鉴定。

2. 材料与方法

2.1. 细胞培养

HaCat细胞(Procell生命科技有限公司，中国)在37℃、5%二氧化碳、DMEM、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素中培养。

2.2. 蛋白交联、细胞裂解

HaCat细胞以400 mJ/cm²照射1次，在冷洗缓冲液(1×PBS，0.1% SDS，0.5% NP-40和0.5%脱氧胆酸钠)进行裂解，向液体中添加200 U/mL RNase抑制剂、蛋白酶抑制剂鸡尾酒，在冰上孵育30 min并在4℃并在10,000 rpm条件下离心10 min，清除细胞裂解液。加入RQ I (Promega, 1 U/μL)至最终浓度为0.05 U/μL，在37℃的水浴中孵育30 min。

2.3. 免疫共沉淀

取出裂解液总体积的1%作为Input对照组样本，细胞裂解液加入15 μg S100A4抗体和对照IgG抗体，然后在4℃下孵育过夜。随后沉淀物进一步与蛋白A/G Dynabeads在4℃温度下孵育2小时。用磁铁去除上清液后再用裂解缓冲液、高盐缓冲液及PNK缓冲液洗涤2次。将悬液在70℃的热块中孵育20 min，释放含有交联RNA和涡旋的免疫沉淀RBP。最后通过用Trizol试剂(生命技术)纯化RNA。

2.4. 文库制备

使用KAPA RNA Hyper Prep Kit (KAPA, KK8541)按照制造商的程序制备cDNA文库。建库结果使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行双端(paired-end)测序，获得了高质量的数据。

2.5. 数据分析

在cDNA文库构建的过程中对捕获的mRNA/ncRNA进行随机片段化，随后加接头并进行RT-PCR。然后进行Clean reads碱基质量分析、GC含量分析，然后在去掉index序列、建库平衡用随机碱基及截取掉后面低质量的碱基后，我们用获得的clean reads进行有效长度分析。然后参考基因组版本为GRCh38，鉴定S100A4结合的靶RNA在基因组中的分布情况。根据测序深度和覆盖度选取某一固定长度为单位(bin)将基因组等分，统计每个bin中的reads数目。模拟数据中reads的分布情况，来作为背景噪音，然后基于zero truncated negative binomial (ZTNB)来寻找reads分布显著高于背景的位置。在此过程中每个bin都会获得一个p-value，根据p-value进行显著性筛选，得到真实的结合峰。

2.6. 结合峰相关基因KEGG通路富集分析

利用blast将参考基因组的基因序列比对到KEGG数据库，进行KEGG注释；根据结合峰相关基因(peak associated gene)注释信息，统计每个基因所在的KEGG pathway，根据每个pathway的基因数目，以及背景中此pathway的基因数目，用超几何分布检验分析每个pathway的显著性；选取排名前10的pathway及其校正p-value和百分比图进行展示。

3. 结果

3.1. 高通量测序

在Illumina NovaSeq平台进行高通量测序及数据基础分析，通过对文库进行150 nt对端测序，获得高质量的有效序列，如表1。

Table 1. Statistics of valid sequence results after sequencing by the Illumina NovaSeq 6000 sequencing platform

表1. Illumina NovaSeq 6000测序平台测序后的有效序列结果统计

3.2. 数据高级分析

使用Piranha软件，以Input对照组样本为背景，对S100A4-FLag实验样本的去除冗余序列进行结合峰寻找，2次实验样本得到的峰值数分别为723和570，并且两次实验重复间获得的S100A4的结合峰的重叠性较好，共获得282个重复结合峰。此外，两次实验间获得的S100A4结合基序一致性较好，富集在C-rich和CG-rich的基序，表明S100A4在HaCat中特异性结合靶RNA。

3.3. KEGG分析结果

为了确定与S100A4蛋白结合的RNA参与的分子功能、信号传导途径及生化代谢途径，进一步对峰值关联的基因用KEGG分析显示：S100A4结合的RNA主要参与了MAPK信号通路、核糖体、内质网中的蛋白质加工、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、慢性髓样白血病、弓形体病、结肠直肠癌、破骨细胞分化、军团杆菌病等功能，如图1。

Figure 1. KEGG Pathway enrichment analysis of peak-related genes

图1. 结合峰相关基因KEGG Pathway富集分析

4. 讨论

银屑病是一种全身性慢性炎症性皮肤病，发生在各种环境因素下的遗传易感个体中，可引发一系列复杂的炎症级联反应和免疫反应障碍，其中多基因遗传模式占优势主导地位 [6] 。转录组测序研究结果表明银屑病皮损、非皮损和正常皮肤具有不同的基因表达谱，这些差异表达基因不仅参与到对各种环境刺激(压力、创伤、细菌、病毒、化学、药物等)的反应，而且与银屑病的炎症发生密切相关，如参与角质形成细胞或表皮分化的基因，如：IL-1β，IL-17A，IL-20基因家族 [12] 。全球约有1.25亿人患有银屑病，其中中国约611万名患者。除皮肤症状外，银屑病患者还要承担罹患癌症、抑郁症、代谢综合征和心血管疾病等并发症的风险 [13] 。银屑病发病机制复杂，目前尚未完全阐明，经双胞胎研究、连锁分析和全基因组关联研究(GWAS)证实，银屑病是由位于不同位点上的多个基因相互作用，影响复杂的炎症信号通路，导致免疫失调 [14] 。既往研究表明S100A4具有广泛的生物学功能，细胞内S100A4调控细胞稳态和分化的一些基本过程，如基因转录、细胞骨架重排和细胞增殖 [15] 。细胞外，S100A4蛋白主要通过刺激炎症通路和各种炎性细胞分子的表达来激活各种生物过程，这些炎性分子及相关基因通路与银屑病的炎症发生密切相关 [4] 。与健康皮肤相比，S100A4在银屑病皮肤真皮层中的T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种炎症细胞中的表达显著上调，表明S100A4是银屑病发病中的一个活跃的炎性细胞因子，然而目前S100A4如何影响银屑病发生发展的炎症调控机制尚不明确。本研究应用iRIP-seq技术研究S100A4作为RNA结合蛋白调控银屑病炎症发生的潜在作用，这对开发新的和有效的银屑病治疗策略至关重要。

本研究表明S100A4结合的靶RNA基因显著富集到了丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases, MAPK)信号通路，该信号通路在银屑病组织病理形成过程中扮演着关键角色。既往研究表明，相较于银屑病未病变皮肤，银屑病病变皮肤组织中MAPK家族的p38的磷酸化水平、细胞外信号调节激酶活性及c-Jun氨基末端激酶显著增加，从而导致炎性细胞因子过量释放、角质形成细胞的异常增殖，加剧银屑病的炎症反应 [16] 。Xu等 [17] 人通过网络药理学、UPLC-Q-TOF-MS技术和分子生物技术方法探究抗银屑病草药成分荆防颗粒在咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型中的分子机制，结果显示荆防颗粒通过p38a MAPK信号通路抑制骨髓源性树突状细胞的成熟和活化来减轻银屑病样皮炎症状，表明MAPK信号通路是一个可靠的银屑病干预靶点。Cerez等 [18] 人研究显示与未受刺激的单核细胞相比，用S100A4刺激过的单核细胞IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的表达显著上调，这种作用部分是通过激活P38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶来实现的，因此我们的研究结果进一步支持S100A4对MAPK信号通路的调控作用，然而目前S100A4-MAPK轴在银屑病中的作用尚未证实，未来需要更多的研究证实它在银屑病中的意义。

本研究的另一发现是S100A4结合的靶RAN所在基因富集到了糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物–晚期糖基化终末产物受体(Advanced Glycation End Products-receptor of Advanced Glycation Endproducts, AGE-RAGE)信号通路。目前已有研究证实，S100A4可以与RAGE受体结合，但在银屑病中未有进一步的验证 [18] 。既往研究表明，银屑病关键炎性细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素易导致糖耐量受损和2型糖尿病 [19] ，表明银屑病和糖尿病之间存在一些共同的易感基因 [20] 。AGE-RAGE信号通路是一个和糖尿病及其并发症密切相关的通路，可以激活并促进炎性反应、氧化应激，最终导致胰岛素抵抗及其并发症的发生 [21] 。既往研究表明，AGE-RAGE信号通路在糖尿病肾病的发生发展中扮演了关键角色，在糖尿病肾病中的作用机制主要是激活核转录因子-κB，刺激血管内皮生长因子、转化生长因子-β1的产生，从而诱导单核细胞趋化蛋白-1表达增强，导致肾素血管紧张素导致细胞功能紊乱 [22] 。另外一项基于网络药理学和体外实验的研究表明，芦丁可能通过抑制AGE-RAGE信号通路来减轻咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮肤炎症症状，芦丁是决银颗粒的主要成分，有改善皮肤损伤和抑制细胞增殖的作用，在临床上用于治疗银屑病 [23] 。由此推测，S100A4对AGE-RAGE信号通路的调控在靶向治疗银屑病及其并发症方面具有广阔的前景。

此外，本研究还发现S100A4结合破骨细胞分化相关基因。既往研究发现，约30%的患者会出现银屑病关节炎，这是一种由破骨细胞介导的破坏性关节疾病 [24] 。据报道，与健康对照相比，银屑病关节炎患者破骨细胞的激活和骨吸收选择性增强 [25] 。S100A4对破骨细胞功能的调节已在类风湿关节炎、牙周炎等炎症性疾病中作了相应的研究，表明S100A4在骨稳态的炎症调节中扮演了关键角色 [26] [27] ，然后这种功能在银屑病中目前未发现有相关的报道。因此，我们的研究进一步支持了S100A4调节破骨细胞功能的观点，为揭示S100A4如何影响银屑病关节炎发生发展中的分子机制提供了新的视角。

总之，我们的研究表明S100A4对银屑病炎症的发生具有潜在的调控作用。目前，S100A4作为一种关键的炎症介质在银屑病中的研究很少，我们的研究可能为进一步揭示银屑病的致炎机制提供新的见解。在本研究中，我们在HaCat细胞模型中进行了验证，但在临床样本和动物模型中验证实验也很重要。未来的研究中，有必要扩大样本量，弥补研究的局限性，继续探索S100A4在银屑病发病中的奥秘。

资助项目

新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(2022D01D52)。

NOTES

^*通讯作者。