环形RNA在肿瘤中的研究进展

Research Progress of Circular RNA in Tumors

摘要: 现阶段人们对非编码RNA不断研究，发现非编码RNA不仅参与人体的正常生理进展，还与疾病的发生有关，这些非编码RNA可能是疾病诊断和治疗的新途径。环形RNA (circular RNA, circRNA)是近些年来发现的与肿瘤有关的非编码RNA，在哺乳动物体内表达，能够调控基因的转录过程。circRNA是一个闭合环状结构，是一种内源性的RNA分子。近些年来的研究发现circRNA在很多不同来源的肿瘤疾病中发挥作用，例如：胃癌、乳腺癌、肝癌等，circRNA能够通过吸附相关的miRNA发挥作用，miRNA又影响下游靶基因的表达，因此circRNA可以同时参与多个生理和病理过程。我们对circRNA在肿瘤中的研究进展进行综述。

Abstract: At present, people continue to study non-coding RNA, and find that non-coding RNA is not only in-volved in the normal physiological progress of human body, but also related to the occurrence of diseases. These non-coding RNAs may be a new way for disease diagnosis and treatment. Circular RNA (circRNA) is a non-coding RNA found in recent years, which is expressed in mammals and can regulate the transcription process of genes. CircRNA is a closed loop structure and an endogenous RNA molecule. In recent years, it has been found that circRNA plays a role in many tumor diseases from different sources, such as gastric cancer, breast cancer, liver cancer, etc. circRNA can play a role by adsorbing related miRNA, which in turn affects the expression of downstream target genes, so circRNA can participate in multiple physiological and pathological processes at the same time. We review the research progress of circRNA in tumors.

1. 引言

胃癌是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤，胃癌的致死率极高，在各种类型的恶性肿瘤诱导的相关死亡原因中排名第3位。我国癌症相关的数据统计分析结果显示，预计有约429.2万的新增恶性肿瘤患者，预计有281.4万人由于恶性肿瘤而丧命，在这些恶性肿瘤中，胃癌的发病率以及致死率均排名第二位 [1] 。近些年来，虽然胃癌的诊断以及治疗技术取得了一定进步，但由于胃癌患者近5年的生存率仍然较低，还不能满足需求，因此，现阶段仍然需要寻找有效的干预措施抑制胃癌的发生 [2] 。目前对胃癌发生的原因仍不明确，很多因素都可能是诱导胃癌发生的原因，这些因素包括内在和外在的，病毒感染、幽门螺杆菌、吸烟、微量元素缺乏、高盐摄入等这些均属于与胃癌有关的外在因素，基因多态性、遗传、基因表观修饰、IL-10、TNF-α等这些均属于与胃癌有关的内在因素 [3] 。幽门螺杆菌致胃癌的机制可能是：(1) 幽门螺杆菌感染后产生氨，可中和胃酸：便于分解硝酸盐的细菌生长，促使硝酸盐转化成亚硝酸盐及亚硝酸铵而致癌。(2) 幽门螺杆菌感染引起胃粘膜慢性炎症加环境致病因素，加速黏膜上皮细胞的过度增殖，游离的自由基增加则引起DNA损伤，诱发基因突变致癌。高盐饮食破坏了胃黏膜的保护层，使致癌物与胃黏膜直接接触。胃癌的形成与胃黏膜形态以及生物学特征异常有关。以前的研究结果表明，胃癌进展和转移过程中除了与基因异常表达有关之外，还与组织细胞中的非编码RNA的表达有关，如lncRNA、circRNA等 [4] 。

过去的几十年中，很多科学家认为恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭以及迁移等都是由于恶性肿瘤的进展而引起的。随着研究的不断深入，很多报道显示，肿瘤微环境影响肿瘤进展。TAFs是肿瘤微环境的重要组成部分，TAFs可以诱导肿瘤的增殖、迁移以及浸润、转移，TAFs能够分泌一系列各种不同的生长因子、趋化因子、细胞因子以及降解ECM的蛋白酶 [5] 。肿瘤间质主要是由细胞外基质、免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等组成，肿瘤间质是一个促进肿瘤进展以及阻碍药物分布的有效屏障。纤维蛋白、整合素、蛋白酶、结构蛋白、蛋白聚糖等共同构成ECM [6] 。很多研究表明，肿瘤周围的TAFs可以通过细胞和细胞之间的复杂相互作用以及分泌各种诱导侵袭的分子如炎性介质、细胞因子以及趋化因子等诱导肿瘤的转移 [7] 。肿瘤细胞和TAFs二者中间构成一个串联信号干扰，这可能直接影响了临近细胞之间以及细胞基底膜、外基质的特征和功能。目前人们已广泛明确，癌细胞破坏基底膜是其进入血液循环系统中的重要步骤 [8] 。另外，重组以后的细胞外基质中的相关蛋白还可以促进某些特定相关基因表达的改变，而这些基因参与细胞骨架以及结构支架的组成。还有研究认为，TAFs有潜在的侵袭能力 [9] 。由于肿瘤微环境的复杂性，现阶段还不能明确的判断上皮细胞还是TAFs对肿瘤侵袭和迁移更为有利。现在的研究已经证实TAFs可以发挥类似结构向导的作用，进而诱导肿瘤细胞侵袭和转移 [10] 。在共培养的实验研究中发现，基质来源的细胞是主要的侵袭细胞，其可以通过将基底膜以及细胞外基质降解而诱导促进肿瘤细胞的浸润和转移 [11] 。还有研究认为，TAFs能够形成一个壁龛结构而促进癌细胞在临近组织中的生长，诱导肿瘤的转移和远端浸润 [12] 。其机制：细胞–细胞直接接触途径TAFs可与其临近的肿瘤细胞直接接触，促使肿瘤自原发部位向远端进行转移；旁分泌途径TAFs可以分泌多重可溶性的细胞因子，主要包括趋化因子配体12，转化生长因子β和肝细胞生长因子，进而促进肿瘤细胞的增殖和转移；免疫调控途径TAFs通过免疫细胞的募集及分泌免疫抑制相关因子从而促进肿瘤逃避的免疫应答。

最近的几十年来，伴随超大规模的转录组科研工作的不断深入和新的高通量测序手段的普遍使用，以前被人们广泛接受的经典理论也受到了挑战和质疑，例如，调控基因表达的途径、遗传学法则DNA-RNA-蛋白质等等 [13] 。很多科学家都发现：人类基因组中有超过93%的DNA能够被转录形成RNA，而只有2%的DNA可以被翻译形成2万多种的蛋白质，而剩下的DNA转录产生不能编码蛋白质的RNA，也称为非编码RNA。非编码RNA有转录功能，没有开放阅读框，因而也不能编码蛋白质，常见的非编码RNA主要有核糖体RNA、核小RNA、转运RNA外、端粒酶RNA、miRNA以及siRNA，人们根据非编码RNA长度的不同，把非编码RNA分成了短链非编码 RNA以及lncRNA两大类，短链非编码RNA是指长度不高于200 nt的一类非编码RNA，主要有微小RNA、siRNA以及Piwi作用RNA、核小RNA等等；长链非编码RNA的长度大于200 nt，长链非编码RNA是非编码RNA中数量最多的，占总的非编码RNA中的约80%左右 [14] 。在以后的实验研究中发现，非编码RNA具有十分广泛的多生物学功能 [15] ，目前已知非编码RNA参与影响染色体产生和结构稳定、RNA的剪切修饰、蛋白质稳定和转运、转录调控等多种生物学过程 [16] 。

circRNA是一类最新研究发现的一种新型的非编码RNA，其是前体RNA经过反向剪接而产生的，其首尾相连形成一个闭合的环状结构 [17] 。在上个世纪的70年代，研究者首次在RNA的病理中发现了circRNA，随着研究的深入，研究者在人体组织、酵母、小鼠等多种生物中发现了circRNA的踪迹 [18] 。但是由于研究技术手段的限制，人们对circRNA的认识并不深入，科学家们在很长一段时间内认为circRNA是转录过程中的“垃圾产物” [19] 。在最近的几年中，生物信息学研究手段得到不断发展，带动了人们对circRNA的研究，也是由于这个原因，人们对circRNA的功能也得到的巨大改变 [20] 。

2. circRNA的来源

现阶段已经发现的有几种产生circRNA的途径。多数的circRNA是来源于编码基因的外显子，依赖于RNA聚合酶II而产生形成。circRNA的产生途径和经典的线性RNA剪接途径明显不同，circRNA的剪接机制为：其上游3’的剪接供体和其下游的5’剪接受体能够经过反向的剪接方式特异性的结合而构成包含3’-5’的磷酸二酯键环形RNA分子 [21] 。还有很多外显子circRNA以及很多的外显子–内含子circRNA是经过在两侧内含子通过反向配对方式优先产生的RNA的双链结构，RNA双链结构通过反向的剪接作用而诱导circRNA的形成 [22] 。在位于两侧的内含子序列中含有反向的串联重复序列的情况下，从而构成长度较大的circRNA。在一定的情况下，RNA双链结构十分稳定时不能形成circRNA。内含子circRNA的形成方式与位于两侧的特异的反向互补短的内含子序列有关，这些内含子序列中多存在有相似的保守区域，例如：5’剪接端含有一段大小为7nt的结构，这个结构富含GU碱基，而其分支点中包含有富含Ｃ碱基的序列，这两侧的序列通过互补配对而构成了一个套索结构，再经剪接体将分支序列去掉，从而构成了3’-5’的磷酸二酯键构成的内含子circRNA，这种内含子circRNA的形成机制又被称为套索环化驱动 [23] 。还有一些反式的激活因子如RNA结合蛋白RBPs也参与circRNA的产生过程，其可以特异性的结合在两侧的内含子序列中，从而构成剪接供体以及剪接受体桥梁，促进circRNA的生成，这种因子主要包含反式激活因子RNA结合蛋白FUS、Quaking、NF90/NF110等 [24] 。

3. circRNA生物学特点

伴随着生物信息研究手段不断的进步和广泛研究，环状RNA的许多生物学特性正在被逐渐揭示，现在总结circRNA的主要特征如下：(1) circRNA在真核生物细胞内存在，如：人、线虫、果蝇、酵母菌、鼠等。(2) 生物学性质较为稳定，circRNA与传统线性RNA不同，其有封闭的环状结构，没有5’→3’极性和3′poly A的末端，因此也不易受到核酸外切酶 RNase R的降解作用，circRNA能够更加持久稳定的在真核细胞中存在。(3) 很多的circRNA是由外显子组成的，少数是由内含子组成，因此circRNA大部分在细胞质中存在，还有少部分在细胞核内存在。(4) circRNA有明显的时空特异性，其在不同组织以及同一种组织的不同的发育阶段，circRNA的表达水平的变化千差万别。(5) circRNA在不同的物种之间有高度保守性。(6) 大多数的circRNA不能编码蛋白质。(7) 还有些circRNA可以吸附miRNA，二者相互作用以后能够在转录或者转录后水平影响基因的表达，参与生命进程 [25] [26] 。

4. circRNA的生物学功能

4.1. circRNA可以作为竞争性的内源RNA

circRNA可以作为miRNA“海绵”，circRNA中包含数量以及种类大不相同的miRNA的应答元件(MRE)，circRNA可以与miRNA的结合位点特异性的结合并吸附相关的miRNA，从而竞争性的抑制miRNA和相应位点的作用，进而影响下游靶基因蛋白的翻译 [27] 。circRNA (ciRs-7)来源于CDR1基因，其能够结合并吸附miR-7，进而抑制miR-7的活性发挥，因此，ciRs-7能够通过间接作用促进与有关的miR-7相关靶基因转录和表达，进而影响神经电生理产生以及兴奋性神经元中的突触活性 [28] 。ciRS-7结构中含有约70个的miR-7的MRE，ciRS-7和miR-7竞争性的结合以后能够影响中脑中神经组织生长和发育，提高心血管疾病发生概率，调控肝癌以及结肠癌发生，诱导胰岛素细胞胰岛素分泌 [29] 。还有研究显示，circRNA MYLK在膀胱癌中发挥作用，其可以作为竞争性的内源RNA影响膀胱癌进展，过表达circRNA MYLK的膀胱癌细胞中的miR-29a相对表达水平降低，反之，下调circRNA MYLK促进膀胱癌细胞中miR-29a的表达，但是miR-29a不具备circRNA MYLK表达的作用 [30] 。circHIPK3来源于HIPK3基因Exon2，已经发现其可以与9个miRNA特异性的结合，另外在circHIPK3上找到了18个可能结合位点，circHIPK3可以与miR-124结合而降低miR-124活性，诱导肿瘤细胞的恶性增殖 [31] ，这些结果说明，circRNA参与竞争性的内源RNA的网络调控作用。

4.2. 调控蛋白质功能

研究认为，circRNA属于非编码RNA，但是也有少数的circRNA可以翻译形成蛋白质，发挥作用，在circRNA中有m6A修饰，其在受到热休克刺激后可以诱导circRNA的翻译过程 [32] 。研究者对10例临床上病理诊断为胶质母细胞瘤的肿瘤组织以及正常脑组织分析发现，经过Sanger测序、RNA印迹、液相色谱Tandem质谱仪等方法证实了circ-FBXW7能够编码产生一种FBXW7-185aa蛋白质，其具有抵抗胶质瘤的进展 [33] 。circRNA circ-SHPRH来源于SHPRH基因，在脑胶质瘤中存在表达，其可以编码形成多肽，这也首次证实了在人类的转录本中广泛存在着重叠的密码子编码形成的蛋白质产物，这种多肽是一类跨过接口位点之后而终止翻译形成的产物，这个研究结果再一次的更新广大科学家们对circRNA的认知，也为进一步的拓展circRNA的研究方案和思路提供了有力的保障 [34] 。在对果蝇大脑组织中的核糖体印迹分析结果发现，很多circRNA能够翻译并产生蛋白质、多肽。环状RNACirc-ZNF609可以翻译产生蛋白质，这个蛋白质调控肌肉的形成和发生。位于Linc-PINT上的第二外显子可以以自身环化的方式产生Circ-PINT，该circRNA经过内部的核糖体插入位点而驱动翻译形成一个87个氨基酸构成的PINT87aa多肽，PINT87aa多肽能够阻碍恶性胶质瘤的进展 [35] 。还有研究发现circPVRL3能够经过核糖体插入位点、m6A以及开放阅读框(ORF)等而形成蛋白质 [36] 。目前对circRNA翻译产生蛋白的研究较少，对于其机制也不完全明确，还需要深入研究。

4.3. circRNA影响亲本基因表达

circRNA可以通过不同的方式影响其亲本基因表达：首先，circRNA可以与RBPs结合而影响基因的表达过程；其次，在circRNA的产生过程中，circRNA能够通过内含子之间的竞争性互补配对而与线性RNA构成稳定的动态平衡状态，进而影响其mRNA的表达过程，调控蛋白质的翻译；最后，circRNA能够通过RNA-RNA、RNA-DNA、RNA-蛋白质这3种方式相互作用，从而构建形成关键的生物网络进而影响下游靶基因的表达 [37] 。有研究发现，circRNA能够将RBPs分类、存储或传递特定的位置而发挥作用 [38] 。还有研究显示，circRNA能够与RBPs稳定结合，而RBPs已经被证明能够参与miRNA依赖或独立发生的肿瘤。GDA基因和SERPINB5基因的mRNA表达水平与它们相对应的has-circ-0138960以及has-circ-0047905的调节出现一致性 [39] ，这也被相关研究证明，当两种circRNA在胃癌细胞中被敲低之后，相对应的基因就会表达下调。人的细胞中，通常会聚集在细胞核中的ciRNA，来源于套索内含子，而且相互作用于PolII机制通过顺式调节的方式影响亲本基因的表达。大部分来源于内含子、外显子的环化的可变的EIciRNA可以与U1SnRNP结合成为调节复合物，并且相互作用于PolII机制也会影响基因的表达 [40] 。有RBP、miRNA海绵作用并且来源于外显子的circRNA，通过其它机制在mRNA的调控中也发挥着间接作用。

4.4. 作用RNA结合蛋白

RBP，英文全称RNA binding protein，又叫做RNA结合蛋白，在转录完成之后的基因的表达和调节中发挥着不可或缺的作用。RNA相关的众多生物学功能中都发挥着重要作用，RNA的转运、选择性剪接RNA、RNA稳定性的维持以及RNA的翻译等都与之相关 [41] 。在细胞的应答中也发挥着重要作用，例如细胞的氧化应激、凋亡衰老、增殖分化以及迁移。mRNA的稳定以及RNA的剪接模式都会被有竞争性结合的circRNA和RBP形成的海绵改变，这也会是已经被证明了 [42] 。虽然RBP结合位点在circRNA上比在mRNA上要少，但是有研究还是证明两者有相互作用的关系存在。RBP的表达也会受circRNA的调控，p53基因的生成就受编码于来源于WWOX肿瘤抑制因子亲本基因的KIRKOS-71和KIRKOS-73两个circRNA的调节。has-circ-0055538参与到信号通路p53/Bcl-2/caspase中，从而影响口腔鳞状细胞癌发生 [43] ，近期这也被证实。

4.5. 其他生物学功能

疾病的发展往往与很多因素有关，circRNA在独立完成调节基因表达和众多生物学进程的同时，也会协同其它生理机制调节疾病的发生和发展 [44] 。以miR-124-2HG为靶点的circHIPK2在转录后，立即联合内质网应激及自噬，从而导致星形胶质细胞的活化出现 [45] 。有报道称干细胞的多能性调控也受到circBIRC6的参与调控，非编码而且保守，并广泛存在于细胞中的circRNA，目前人们对之的认知还比较少，它有可能具备更强大的生物学功能，进一步的研究终还是很有必要的 [46] 。

5. 疾病与CircRNAs

5.1. 神经系统疾病与circRNA

目前常见的神经性疾病有肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、阿尔茨海默症(Alzheimer disease, AD)以及帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等，经研究表明这些疾病都与circ RNA有着不可分割的关系。最新研究表明，在人的脑部组织中发现circ RNA大量表达，并且有可能参与神经的可塑性以及调解突触功能 [47] 。进一步的研究发现，miR-7-circRNA系统存在AD患者的脑部之中的海马CA1区域具有重要的调节作用。AD患者的脑组织中，ciRS-7的缺失引起可以与它产生相互作用的miR-7的表达水平显著上调，结果导致与其有关的信使RNA的靶点以及表达产物的量下调(如泛素连接酶E2A，ubiquitin conjugase protein，UBE2A)。UBE2A是泛素化循环的中枢效应物，借助吞噬作用便于清除淀粉样的多肽，它的含量在AD患者的脑组织中较低，能促进生成淀粉样蛋白，这可能也是AD的主要发病机制之一 [48] 。miR-7的靶基因是α-突触核蛋白(Alpha-synuclein)，PD的发生发展有可能与其过度的表达参有关，miR-7-ciRS-7相互作用的结果可能导致PD的发生。研究发现几个源自与异常神经发育的表型有遗传关系的circRNA基因位点，如RMST，DOPEY2和FBXW7 [49] 。此外，有研究者也发现一些的散发型ALS病例中也会发现在细胞质中RBP反式激活应答的DNA结合蛋白-43 (transactive response DNA binding protein 43000, TDP-43)逐渐累积，脱支酶1 (debranching enzyme 1)活性被敲低能引起外显子片段之间的细胞质增加，这对于抑制原代大鼠神经元和人神经元细胞系中的TDP-43的毒性是有作用的 [50] ，这表明进一步使用circRNAs作为ALS的潜在治疗手段是具备可能性的。

5.2. 心血管系统疾病与circRNA

作为首次发现确定并且与常见的一些单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)有关联的circRNA其中一个，人类INK4a/ARF的转录本可以调控cANRIL的表达，同时，INK4a/ARF位点的抑制也会受到cANRIL剪接的影响 [51] 。动脉粥样硬化风险的增加都可能与这些有关系。动脉粥样硬化其中一种已经知道的危险因素就是缺氧，作为关键刺激因子与血管的生成有很大关系，circRNA可能与之有重要的调节关系。之后就研究表明，一种叫做cZNF292的circRNA就在血管的内皮细胞中发现，就证明了其生物学功能 [52] ，cZNF292具有调控血管再生的功能，同时它的表达又受到缺氧条件的调节。之后有研究者针对人类的心脏做了circRNA的表达谱，发现心脏中含有大量的circRNA，某些重要的心肌基因，包括DMD、RYR2以及Titin等基因，都与circRNA有一定的关联性 [53] 。接下来又有学者针对circRNA可以在心血管疾病中发挥重要的作用提供了强有力的证据，通过针对健康人群以及患者人群的心脏以及患者外周血样品做了RNA测序分析，找到了与心脏有关的候选circRNA有575个，并且发现hsacirc-0124644在患者的组织中出现了显著性的上调表达 [54] 。

5.3. 糖尿病与circRNA

糖尿病属于慢性疾病，长期伴随于人们影响着人们的健康，高血糖的长期存在会引起全身的多种组织和器官(包括血管、肾脏、心脏、神经等)病变，circRNA在糖尿病的并发症中具有非常重要的作用。糖尿病患者血管的病变是最常见的糖尿病并发症之一，这也是引起糖尿病的病人死亡的最主要原因之一，所以早期诊断及更理想的治疗方法就显得十分重要 [55] 。已有报道称患有糖尿病的转基因小鼠模型的胰岛β细胞中miR-7的过表达，会对β细胞去分化的功能造成影响，导致胰岛素的分泌水平降低，引发糖尿病。同时发现ciRS-7可以与miR-7形成拮抗作用，生信分析发现能够增强胰岛素的转录的基因Pax6以及能够调节胰岛素颗粒的分泌的基因Myrip竟然是miR-7的潜在基因靶点。这两个基因靶点受到ciRS-7/miR-7通路调节，进而导致胰岛素的分泌加大，糖尿病的治疗可以从这个角度出发寻找新的治疗手段 [56] 。不仅在糖尿病上circRNA有着巨大的潜力，在与糖尿病有关系的其他疾病中，他也发挥着很重要的作用。近年来人们发现抑郁症与2型糖尿病(T2DM)有着密切相关，科学家针对T2DM患者还伴有抑郁症的患者做了circRNA谱的自然表达分析，hsa-circ-005019 、hsa-circ-100918、hsa-circ-015115、hsa-circ-003251、等这些circRNA都出现了差异化表达，未来可以考虑作为生物标志物以及潜在治疗靶点应用在治疗、诊断和干预研究T2DM合并抑郁症中 [57] 。还发现Hsa-circRNA11783-2可以与T2DM合并以及与CAD的相关性最强，为CAD与T2DM的研究做出了很大的贡献。研究者针对糖尿病性相关视网膜病变的研究表明，circHIPK3在视网膜血管的功能障碍中发挥着可以为之减轻的重要作用 [58] ，这也为circRNA在糖尿病的疾病控制中提供了可靠的证据，成为新生血管疾病的诊断以及治疗提供了新思路。随着糖尿病患者体内大量circRNA被发现，其重要性已经引起了学者们的极度重视。已有众多的研究说明糖尿病与circRNA有着紧密的关联。作为非侵入性的标记物可以轻松通过外周血样本进行检测，敏感性和特异性都很高，所以很可能成为糖尿病前期的诊断潜在工具，但更多的研究结果也需要在更大的更多样化人群之间进一步地验证 [59] 。

6. 肿瘤与circRNAs

近些年来，在多种肿瘤中circRNA的异常表达还有对相关通路的调控作用等方面都有较多的报道。circRNA在各种肿瘤中的研究不断地涌现，越来越被人们关注，各方面的深入研究越来越细化。下面的内容我们针对不同肿瘤中circRNAs的研究做了全面性回顾，期望能为新的研究提供思路 [60] 。

6.1. 前列腺癌与circRNA

有研究发现，前列腺癌(prostate cancer, PCA)患者的癌组织和癌旁组织中一种叫做circAMOTL1L的circRNA，衍生于Amotl1基因，出现了显著性降低的水平。随后导致E-钙黏蛋白表达的下调以及波形蛋白的上调，进一步导致了PCA细胞的侵袭和迁移能力的提高。该研究还发现cir-cAMOTL1L可直接与RBM25基因结合一起发挥生物学作用，RBM25基因还可以被p53直接激活后调节上皮–间充质转化的过程。PCA细胞上皮–间充质的转化过程与cir-cAMOTL1L-miRNA-193a-5p-Pcdha调控轴受到p53/RBM25介导调节 [61] ，这都被证明。接下来有人专门针对前列腺癌患者的癌组织和癌旁组织做了测序分析，发现的异常表达circRNA有1021种。全RNA基因组测序应用于癌组织和癌旁组织，144例样品中筛选出来7232种circRNA与肿瘤相关。肿瘤细胞的生长的促进可以通过miRNA-181与circCSNK1G3的结合实现；其亲本基因转录水平的调节也受circRNA的影响 [62] ，肺癌细胞中90%的circRNA都发挥着极其重要的作用，但是它的线性对应产物却没有这种作用，表明在转录过程中circRNA可以独立发挥作用。

6.2. 乳腺癌与circRNA

目前，乳腺癌中circRNA的相关功能研究越来越多。circRNA有助于乳腺癌细胞的侵袭和增殖，从而抵制凋亡。乳腺癌组织中的hsa-circ 0001982也出现显著性上调，miR-143可以与之相互作用。扩张乳腺癌干细胞和自我更新的能力都会受到VRK1抑制 [63] 。对核因子活化B细胞的κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)信号通路和NOTCH1基因具有调节作用的circRNA-000911/miＲ-449a通路被发现，circRNA-000911具有重要的抑癌作用 [64] 。还有研究发现，在乳腺肿瘤的样本中circ-Foxo3显著性下调。转录因子叉头框蛋白O3 (forkhead box protein O3, FOXO3)的蛋白表达受到circ-Foxo3调节上升表达水平，p53上调的凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis, PUMA)的基因表达也受到circ-Foxo3调节上升，这些都说明在乳腺癌演进中circ-Foxo3发挥复杂作用 [65] 。

将正常人群和乳腺癌患者人群的血液收集后进行circRNA相关基因芯片技术，通过测序发现，其中表达上调的circRNA就有19种，下调的也有22种。研究者还绘制了乳腺癌表达谱，发现has-circ-0001785具备乳腺癌早期分子标记物的潜力。同时对三阴性乳腺癌患者提取的癌组织进行circRNA高通量测序，发现癌细胞中circEPS-TI1 (has-circRNA-000479)也出现了明显升高 [66] 。随后研究者又针对circEPSTI1做了广泛的研究，发现miRNA-6809和miRNA-4753可以与之发生结合，通过发挥海绵作用从而影响bcl11a基因的表达，进而使肿瘤坏死因子相关凋亡和增殖受到影响。有研究针对原发性乳腺癌进行了RNA序列分析，在最终确定的95,843种circRNA中有近20,441种是已知的，其中与相对应的线性基因表达有相关性且呈现负相关或者相关性较差的circRNA就有668种。随后针对乳腺癌的circRNA表达谱做了仔细的生信分析，利用RNA干扰技术降低癌细胞内circCONT2的表达后，类似BT-474和MCF-7这种乳腺癌细胞系存活率显著降低，circRNA在乳腺癌中具有重要的生物学作用 [67] 。TRAF4，全称tumor necrosis factor receptor associated factor 4，又叫肿瘤坏死因子受体相关因子4，在研究中发现它可以与circRNA-MTO1 (has-circRNA-007874)发生相互作用，从而降低TRAF4的活性，进而使Eg5蛋白的表达受到影响，从而使癌细胞的生存力降低 [68] ，这些都有希望成为靶向治疗乳腺癌的新靶点。

6.3. 胰腺癌与circRNA

恶性程度较高、诊断和治疗困难、预后性差这都是胰腺癌具有的特点，因此对于靶向治疗胰腺癌的研究从来都是热点当然也是难点。许多的研究都对正常胰腺组织和胰腺导管腺癌组织进行了测序分析，许多有表达差异化的circRNA都被发现。与淋巴管的浸润、TNM的分期及细胞低生存率密切相关的circ-PDE8A从肝转移到胰腺导管腺癌细胞中被检测到，出现了显著性上调的表现。机制研究表明作为ceRNA的circ-PDE8A可以吸附miR-338从而作用MACC1基因的表达，使肿瘤增殖加快 [69] 。胰腺癌患者的血浆外泌体中表达的circ-PDE8A直接影响着患者的病情进展以及预后等相关。与TNM分期、肝转移和肿瘤血管浸润有关的circ-IARS表达，也在参与分析的85例患者的正常胰腺组织和胰腺导管癌组织中被检测到显著性上调 [70] 。在外泌体中circ-IARS富集，RhoA基因的表达水平和活性都在circ-IARS过表达后提高和增加，对内皮通透性维持有重要作用的因子ZO-1和F-actin的表达水平也分别出现了下调和增加的作用。机制分析发现作为ceRNA的circ-IARS可以吸附miR-122从而减缓作用RhoA基因的抑制表达，F-actin活性增加，ZO-1表达量下降，内皮间紧密连接遭到破坏，增加了血管内皮的通透性，肿瘤的转移和发生得到促进 [71] 。与淋巴转移、脉管侵犯和浸润密切相关的circ-LDLRAD3也在被检测的30例患者癌旁非肿瘤组织和胰腺癌组织中检测到，且在癌组织中有较高的表达水平，敏感性和特异性分别达到了0.8033和0.9355。这些研究都预示着circ-LDLRAD3具备诊断胰腺癌生物标志物的潜在能力。上述的研究表明胰腺癌的发生发展与circRNA密切相关，胰腺癌的预后评估、生物靶向治疗和个体化治疗的新靶标和新依据都可以在circRNA上进一步开发 [72] 。

6.4. 肝癌与circRNA

近年来肝癌出现了发病率随着每年逐渐越来越多，呈现了大幅上升的趋势，现在远高于大部分恶性肿瘤的发病率。甲胎蛋白AFP目前在临床上主要作为肝癌的诊断标志物，开发更多的更有效的诊断和雨后的标志物就非常重要。目前通常采用治疗肝癌的方式是手术，那么要是能够早期发现该病就显得非常重要。最近研究者也把焦点聚集在了circRNA是否可以作为早期诊断的标志物，研究两者的关联，开发新的分子标志物。circ-PVT1的表达被证明在人的肝癌患者的癌旁组织和癌组织中有差异化表达，46例患者组织的qRT-PCR分析表明前者明显低于后者，肿瘤的分化程度、TNM分期以及大小程度都与之相关，通过降低细胞中circ-PVT1的表达后，肝癌细胞的增值能力受到了明显降低的影响 [73] 。有学者发现过表达miR-1324或者敲低circ-0067934，通过western方法检测到Wnt/β-catenin信号通路中的FZD5基因受到了严重的下调。作为Wnt共受体的FZD5是miR-1324的下游靶基因，它的下调导致了Wnt/β-catenin信号通路的激活抑制，miR-1324受到circ-0067934的直接调节，通过恢复试验发现FZD5恢复以及miR-1324的敲低可以逆转circ-0067934敲除给肝细胞带来的副作用，因此miR-1324/FZD5/Wnt/β-catenin轴可以被circ-0067934调节从而影响肝癌的发生发展 [74] 。另有研究发现circ-CDRlas有作为肝癌微血管侵犯的分子标记物，尽管通过测序分析发现108例肝癌患者的组织中circ-CDRlas的表达略有差异，但是统计学上无意义，但是circ-CDRlas在肝癌微血管侵犯患者的组织中却有差异性并且具有统计学意义，发现它的表达水平与肝癌抑制因子miR-7呈现负相关调节 [75] 。circ-ADAMTS14也被发现可以间接作用与肝癌细胞，影响肝癌的发生发展。它在肝癌组织中的水平降低明显，过表达之后引起了肝癌细胞的凋亡，进一步的机制研究发现它调节了miR-572与ceRNA的吸附，进而通过钙调节蛋白1影响肝癌的发生发展 [76] 。又有学者针对circＲNA在肝癌患者的癌组织以及癌旁组织中的表达谱进行了芯片技术和qRT-PCR技术检测，在选取的60例患者中，has-circ-0005075在两种组织中均出现了表达的显著性差异。并且通过进一步地分析发现miR-93-3p、miR-23a-5p、miR-23b-5p、miR-581的结合位点竟然在has-circ-0005075可以找到 [77] 。有研究者就针对肝癌患者的组织样本进行了测序研究，发现89例患者组织中的has-circ-0001649出现了非常高的表达，该circRNA可能与癌栓以及肿瘤的大小有着显著相关性，所以has-circ-0001649具备非常大的治疗新靶标的潜力 [78] 。综上研究都说明circRNA具备肝癌早期诊断以及预后评估的分子标记物的潜力，值得研究开发。

6.5. 结直肠癌与circRNA

结直肠癌细胞中神经纤维蛋白1会被miRNA-370-3p抑制，通过研究发现circITGA7也可以竞争性的结合miRNA-370-3p，从而拮抗它的抑制作用，接下来促进转录整合素α7 (integrin subunit alpha7, ITGA7)以及Ras信号通路的阻断，进一步是结直肠癌细胞的转移和增值受到抑制 [79] 。有研究发现结直肠癌中SH2B1基因的上调受到了miRNA-136与has-circ-0136666竞争性结合后复合物的调节，从而使结直肠癌的发生发展受到促进。circRNA不仅在结直肠癌的发生中有重要作用，而且研究还发现化疗药物的耐药性也可以用它来评估 [80] 。circRNA的表达谱以及测序分析在化疗敏感和化疗耐药的结直肠癌细胞中应用，发现了has-circ-32883的表达水平出现了较明显的差异化，在众多上调或者下调的circRNA中可以用来作为生物标志物来评估化疗敏感。

6.6. 食管癌与circRNA

截止到目前食管癌方面circRNA的研究相对较少，还处于起步阶段，但是也有少量的研究出现。研究发现食管癌组织中circ-0067934的表达量出现了显著性增加，队列研究在51例食管癌患者中采用，miR-98和miR-214与circ-0067934之间可能有某种相对应的通路存在，对食管癌细胞的侵袭和增殖具有十分显著的影响作用 [81] 。circ-0067934的显著上调使miR-98和miR-214相关基因表达受到了抑制，伴随着抑制肿瘤细胞的作用也不在了，促进了食管癌的发生发展。也进一步说明circ-0067934可作为食管癌的新型的潜在的生物标志物和靶向治疗的新靶点。此外，circ-000167与circ-001059也在食管癌患者的病程发展中出现差异化表达被证实，但相关通路的具体途径还缺乏研究 [82] 。伴随生物技术的发展，食管癌方面circRNA的研究也会越来越多，在食管癌诊断与治疗方面有希望得到应用。

6.7. 肺癌与circRNA

美国癌症协会统计预测，人类新发肿瘤中肺癌的发病率在2018年已经位居第二了，并且有最高的致死率。由于出现症状的就诊的时候大部分已经出现了癌细胞转移，所以生存率比较低。近年来研究者开展了大量的研究针对肺癌的靶向治疗新靶点的寻找，也为继发性耐药等问题带来新的治疗方法。Has-circ-0020123的敲除也发现对肺癌细胞的迁移和增殖有抑制作用，敲它在肺癌组织中出现了显著性高表达，与肺癌患者预后不良、TNM分期高、淋巴结转移、分化程度差有着密切关系。机制研究显示体内形成了has-circ-0020123-miR-144-ZEB1/EZH2通路，has-circ-0020123通过ceRNA吸附得来miR-144仪器作用于EZH2和ZEB1基因，进而影像肿瘤的发生发展 [83] 。has-circ-103809就是在circRNA数据库中发现在肺癌组织中显著性高表达的一种，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的癌组织中，通过qRT-PCR检测也发现，44例被检样品中该circRNA均升高，尤其在癌组织中比癌旁组织中表达更高 [84] 。进一步的细胞实验来验证其机制，发现has-circ-103809与肺癌细胞的迁移和增殖能力的抑制正相关。miR-4302可以与之相结合之后提高了ZNF121基因的表达，从而上调了肺癌细胞中的MYC表达水平，加快了肺癌的发生发展。另一种叫做circ-FOXO3的circRNA也被证实在癌细胞的侵袭、迁移和增殖中有重要的抑制作用，从而导致细胞凋亡增加 [85] 。它在NSCLC癌组织及癌旁组织中被检测到，45例患者样品中均出现了显著性下调。进一步机制研究表明它通过与miR-155发生特异性海绵吸附促进了可以抑制肿瘤基因表达的FOXO3基因的表达，这也预示着circ-FOXO3具备治疗靶点的潜力 [86] 。一系列生物学实验Tran-swell、流式细胞仪技术、CCK-8等检测表明肺癌细胞的侵袭和增殖会通过敲除circ-UBAP2受到抑制，cyclinD1、Survivin、FAK、Rac1、CDK6、、MMP2、c-IAP1、Bcl-2等下游基因的表达水平也会随着敲除circ-UBAP2显著下降。类胰岛素样生长因子1 (IGF1)会受到circ-HIPK3和miR-379结合复合物的调节，从而提高癌细胞的增殖，研究者已经从H1975、H520、H1299、H827、H2170、H1650等细胞系检测到了circ-HIPK3的高表达 [87] 。另外它在肺癌组织中也出现了显著高表达，它与miR-124产生吸附作用增加癌细胞的增殖。肺癌患者的癌组织和癌旁组织高通量测序结果显示，10例患者的样品中发生差异性表达的circRNA竟然有185种，在血浆中丰富存在的circ-FARSA也在肺癌组织中显著性高表达，抑制下游基因表达的作用可以通过miR-330-5p和miR-326与其的海绵性吸附来减缓 [88] 。这些研究都表明了肺癌的发生发展中以及前期诊断和靶向性治疗中circRNA都具有重要的作用，它具备分子生物标志的作用潜力。

6.8. 膀胱癌与circRNA

作为常见于男性患者的恶性肿瘤之一的膀胱癌，癌转移会出现在大部分患者中。出于治疗费用高导致经济负担增大，患者极其痛苦考虑，越早的发现从而采取措施治疗就非常重要了，具有预判作用的早期分子标记物的发现有利于减轻痛苦，早期治疗，节省成本。有研究证实了circRNA具备早期分子标记物的潜力，采取了膀胱癌三例患者的癌旁组织和癌组织进行circRNA的表达水平的基因芯片技术检测，在检测的1038种circRNA中具有明显差异表达的竟然有7种。circRNA作用于mRNA的靶点被预测之后，KEGG分析显示代谢信号通路以及细胞的增值都被它们参与 [89] 。研究者对膀胱癌患者中的另一类型非肌层浸润性癌进行了基因芯片高通量测序技术分析，发现在这5例患者的组织中发现了158条表达上调的circRNA以及157条下调的circRNA。进一步通过生信分析发现具有最显著差异的10条circRNA竟然参与了众多的生物学过程，例如参与脂质代谢、调控BCRA1基因的转录、调控细胞膜的功能、调控钙离子以及合成ATP等 [90] 。随后又有研究者针对膀胱癌癌旁组织和癌组织中circCDRlas的表达水平做了检测，结果发现94例被检样品中表达水平均出现了明显下降，这与有人报道的circCDRlas可以作为一个致癌基因存在于肝癌细胞中结论上有着矛盾，这也要求我们需要对circCDRlas在膀胱癌中的作用做更深入的研究。随后在细胞水平上进一步研究了circCDRlas的功能，发现过表达之后癌细胞的迁移、侵袭和增值都受到了抑制。在裸鼠身上的体外实验显示，移植瘤的生长被circCDRlas的过表达抑制了。进一步对circRNA数据库挖掘分析，发现像miR-1290、miR-135a、miR-7等这样的mRNA可以竞争性的结合在circCDRlas上，进一步的生物学实验证实，miR-135a、miR-7受到circCDRlas的下调作用更强 [91] 。更细化的研究表明膀胱癌组织中的miR-135a出现了上调的表达水平，而miR-7则在这些被检测的29例患者的组织中表达无差异化。针对miR-135a和circCDRlas做了相关性分析研究后发现两者出现了负相关的表达方式，circCDRlas可以与对癌细胞具有上调功能的miR-135a竞争性结合从而在抗肿瘤方面起到作用。膀胱癌患者的癌旁组织和癌组织中的circBCR4表达水平出现了显著性降低，通过细胞生物学技术进一步表明，circBCR4的增多导致了细胞的增值出现抑制，从而导致凋亡率也出现了大幅度提高。circBCR4的过表达之后引起了EZH2基因的mRNA以及蛋白的明显性降低表达，生信分析又表明miR-101的结合位点在circBCR4上发现，研究结果提示，circBCR4导致ceRNA有可能会吸附大量的miR-101，从而作用于EZH2基因，导致表达降低，引起癌细胞凋亡 [92] 。circRNA成为新的诊断和预后标志物的潜力非常大。

6.9. 胶质瘤与circRNA

神经胶质瘤细胞也受到circRNA的影响。研究者又通过RNA-seq的技术在神经胶质瘤细胞中发现几种小肽，可能来源于环RNA，其中包含了一种长链的非白蛋白编码RNA p53诱发产生的转录物编码产生的87-氨基酸肽，聚合酶相关因子通过与其相互作用产生的复合物PAF1C，进而导致许多肿瘤基因转录的抑制 [93] 。用正常组织作为对照发现，circRNA和87-氨基酸肽在胶质细胞瘤中的表达水平都显著较低，这也预示着神经胶质瘤细胞中circRNA有着非常重要的作用。有研究表明miRNA-422A可以被circNT5E直接结合之后降低了它的活性，从而使众多基因如Smad2的磷酸化水平、磷酸化蛋白激酶B的表达水平、磷酯酰肌醇-3激酶催化亚单位α的表达水平、以及sox4和NT5e的表达水平都受到降低性调节，最后导致癌细胞的侵袭、迁移和增殖受到影响 [94] 。SHPRH-146aa在肿瘤保护方面也有重要的作用，作为在内部核糖体元件被circ-SHPRH进入后生成的新肿瘤抑制蛋白，全长蛋白与它协同之后共同发挥作用，使降解诱导分子的保护机制增强，起到了肿瘤抑制剂的效果。也有研究者已经表明生存期较长的胶质细胞瘤患者细胞中SHPRH-146aa得到了高效表达 [95] 。

6.10. 胃癌与circRNA

大量的研究证明，在胃癌患者的血浆、唾液、细胞、癌旁组织以及癌组织中检测到circRNA，这也为circRNA成为新的胃癌诊断和预后分子标志物提供了证据。分别检测miR-424-5p在按照病理的分型分组的315例胃癌患者中的表达水平差异后发现，miR-424-5p在胃癌患者的术后复发率方面起到了正相关作用，高表达意味着高复发率。采用qRT-PCR技术探索相关miRNA与靶基因LATS1的关系，结果表明胃癌患者的肿瘤细胞中miR-424-5p下调导致基因LATS1出现高表达，表明该靶基因LATS1对应的circLARP4跟miR-424-5p之间存在某种通路联系。因此，circLARP4既能作为胃癌肿瘤的分子标志物评估患者手术后的预期情况，还可以为胃癌治疗的措施提供新思路 [96] 。还有一种靶基因PVT1对应的circRNA即circPVT1，最近学者通过在5500种circRNA中筛选出来，进一步的生物学实验证明，circPVT1具有miR-5家族成员海绵作用的功能，在肿瘤细胞的增殖中起到正相关作用，升高便导致细胞增殖增加，下调便导致细胞增殖抑制。这也说明circPVT1具有胃癌肿瘤的分子标志物的作用 [97] 。表达水平与CA199水平、淋巴结转移、肿瘤直径、远端转移和TNM分期显著相关的has-circ-0000190最近研究在胃癌组织以及其血浆中的表达量与正常相比显著性下降。进一步通过建立受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)评估has-circ-0000190的临床价值，它的敏感性和特异性均高于常见的如CEA和CA199等非特异性的肿瘤相关性抗原。另外也有研究者进行了另外一个叫做circ-0000467的circRNA临床价值评估，发现它的灵敏度和特异度全部比CA72-4的灵敏度和特异度好很多，并且胃癌组织中出现了显著性的高表达 [98] 。此外，像circ-0006633、circ-0001895等多种circRNA也逐渐被证实，在正常细胞中和在胃癌肿瘤细胞中它们的表达量出现显著异常，但是它们与miRNA之间存在的相互作用机制仍然需要待进一步研究 [99] 。

基金项目

项目名称：山东省医药卫生科技发展计划项目；项目编号：202104010626；课题名称：建立生物荧光成像模型以探究肿瘤相关成纤维细胞在小鼠胃癌进展中所扮演的角色。

NOTES

^*通讯作者。