TM4SF19——一种新的膀胱尿路上皮癌诊断和预后的生物标志物

TM4SF19—A New Biomarker for Diagnosis and Prognosis of Bladder Urothelial Carcinoma

摘要: 近年来科学研究证实四次跨膜L6超家族中的TM4SF19在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，但TM4SF19在膀胱尿路上皮癌(BLCA)中的预后和免疫侵袭中的作用仍不清楚。本研究探讨TM4SF19在肿瘤组织中的表达及其与免疫侵袭的关系，并确定其在BLCA患者中的预后作用。本研究从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中获取了患者的表达谱和临床信息。Mann-Whitney U检验(Wilcoxon秩和检验)分析BLCA中TM4SF19的差异表达。通过功能富集分析以探索所涉及的潜在信号通路和生物学功能。使用单样本基因集富集分析评估免疫细胞浸润。采用Kaplan-Meier法和Cox回归分析来确定TM4SF19的预后价值。构建列线图来预测癌症诊断后1年、5年和10年的总生存(OS)率。结果：TM4SF19在BLCA中过度表达。TM4SF19高表达组中多条途径被显著富集，其中不乏多条肿瘤相关途径及免疫相关途径。TM4SF19表达与巨噬细胞、Th1细胞和其他免疫细胞呈正相关，但与NKCD56bright细胞和肥大细胞呈负相关。TM4SF19的表达水平与T分期、N分期、年龄显着相关。TM4SF19过度表达会导致总生存期(OS)和疾病特异性生存率显着下降。多变量Cox分析将TM4SF19确定为OS的独立危险因素。使用校准图分析了列线图的准确性，显示1年、5年和10年的实际OS值与预测OS值之间具有良好的一致性。结果表明，TM4SF19的上调与疾病的进展和不良预后相关。TM4SF19有望作为BLCA患者诊断和预后的生物标志物。

Abstract: In recent years, scientific research has confirmed that TM4SF19 in the four-transmembrane L6 su-perfamily plays an important role in the occurrence and development of tumors. However, the role of TM4SF19 in the prognosis and immune invasion of bladder urothelial carcinoma (BLCA) remains unclear. This study explores the expression of TM4SF19 in tumor tissues and its relationship with immune invasion and determines its prognostic role in BLCA patients. This study obtained patients’ expression profiles and clinical information from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database. Mann- Whitney U test (Wilcoxon rank sum test) analyzed the differential expression of TM4SF19 in BLCA. Functional enrichment analysis was performed to explore the potential signaling pathways and bio-logical functions involved. Immune cell infiltration was assessed using single-sample gene set enrichment analysis. The Kaplan-Meier method and Cox regression analysis were used to determine the prognostic value of TM4SF19. Nomograms were constructed to predict overall survival (OS) rates at 1, 5, and 10 years after cancer diagnosis. Results: TM4SF19 is overexpressed in BLCA. Multiple pathways were significantly enriched in the TM4SF19 high-expression group, including many tumor-related pathways and immune-related pathways. TM4SF19 expression was positively correlated with macrophages, Th1 cells, and other immune cells, but negatively correlated with NKCD56 bright cells and mast cells. The expression level of TM4SF19 was significantly related to the T stage, N stage, and age. Overexpression of TM4SF19 results in a significant decrease in overall sur-vival (OS) and disease-specific survival. Multivariate Cox analysis identified TM4SF19 as an inde-pendent risk factor for OS. The accuracy of the nomogram was analyzed using calibration plots, showing good agreement between actual and predicted OS values at 1, 5, and 10 years. The results showed that upregulation of TM4SF19 was associated with disease progression and poor prognosis. TM4SF19 is expected to serve as a biomarker for the diagnosis and prognosis of BLCA patients.

1. 引言

BLCA是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据统计，每年大约有573,000例新发病例和213,000例的死亡病例 [1] [2] 。并且由于复发率高，BLCA的终生治疗费用高于其他癌症 [3] [4] 。因此，寻找新的生物标志物和分子靶点对于BLCA的治疗、早期诊断和预后评估至关重要 [5] [6] 。

四次跨膜L6超家族是四 [7] 次跨膜蛋白超家族的一个分支，由六个成员(TM4SF1、TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18、TM4SF19和TM4SF20组成) [8] 。该家族的成员与非共价整合素分子相互作用，以改变组织发育、信号转导途径、细胞活化、增殖、运动、粘附和血管生成 [9] [10] [11] 。根据以往的研究证实，TM4SF1、TM4SF4和TM4SF5的表达与多种肿瘤生物活性有关 [12] - [18] 。TM4SF18在胰腺癌和胃癌中被发现过表达 [19] [20] 。TM4SF19与肺癌的发生和发展有关 [21] 。越来越多的研究表明，四次跨膜L6超家族在癌症预后中起着至关重要的作用 [22] - [29] 。然而，TM4SF19在BLCA进展中的潜在作用仍有待探索。

本研究分析了TCGA数据库中TM4SF19的表达及其与各种临床特征的潜在关联。我们构建了一个涉及TM4SF19及其相关差异表达基因的PPI网络。通过通路富集分析和免疫浸润分析预测了TM4SF19在促进BLCA发展中的作用。我们的研究提供了对TM4SF19在BLCA中的作用的更全面和深入的理解，并为BLCA的新型诊断和预后生物标志物提供了新的见解。

2. 材料与方法

2.1. 数据来源与数据预处理

我们通过TCGA和GTEx数据库获得了泛癌和相应正常组织中TM4SF19的mRNA表达谱 [30] 。随后收集并处理TCGA数据库中BLCA中未配对和配对样本的RNA-seq数据。“limma”和其他R语言(v3.6.3)软件包用于规范化、标准化和可视化 [31] 。

2.2. TM4SF19的差异表达分析

使用R语言(v3.6.3)分析数据，使用ggplot2 [v3.3.3]可视化差异分析结果。采用Mann-Whitney U检验(Wilcoxon秩和检验)分析泛癌中TM4SF19的差异表达。采用Shapiro-Wilk正态性检验分析TM4SF19在配对和未配对样本中的表达谱数据，然后采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney U检验(Wilcoxon秩和检验)进行分析。最后，ROC使用pROC软件包[v1.17.0.1]对数据进行分析，以确定TM4SF19的诊断准确性。上述所有分析均将p < 0.05定义为具有统计学意义。

2.3. 高低表达组和低TM4SF19表达组差异表达基因(DEGs)分析

对TM4SF19高表达组和低表达组中差异表达基因(DEG)的分析将TM4SF19高表达或低表达的TM4SF19表达水平分别统计为高于或低于中值。差异表达分析以调整后的p值<0.05和|Log2-foldchange| > 1。为了可视化筛选出的差异基因的火山图并分析PPI网络，我们使用了Cytoscape和STRING数据库 [32] 。使用MCODE筛选hub基因。随后使用hub基因来说明TM4SF19基因的共表达模式。

2.4. TM4SF19单基因表达相关性分析

对于转录组数据，使用STAT包进行单基因表达相关性分析。分析结果筛选相关p值为0.05的基因，按降序排列|Pearsonvalue|，并选择前30个相关性进行基因共表达热图，同时选择前300个相关性进行GO和KEGG功能富集分析。

2.5. 免疫细胞浸润的功能富集和分析

通过GO、KEGG和GSEA功能富集分析获得了与TM4SF19最相关的基因 [33] 。选择基因集“h.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt [Hallmarks]”进行GSEA分析 [34] 。我们将富集显着性阈值定义为错误发现率(FDR) < 0.25且p.adjust < 0.05。

分析TM4SF19-高表达组和TM4SF19-低表达组之间的24种免疫细胞浸润水平，并通过ssGSEA算法计算相应的富集分数 [35] [36] 。最后，我们使用circlize包[版本0.4.12]通过绘制弦图来可视化相关性 [37] 。我们将显着相对阈值定义为p值 < 0.001。

2.6. 临床统计分析、模型构建和预后评估

采用Wilcoxon符号秩和检验来检查TM4SF19与临床病理特征之间的关联。使用Cox回归和Kaplan-Meier方法分析亚组患者的TM4SF19表达水平的总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)、无进展间期(PFI)和其他临床参数。多变量Cox分析评估了TM4SF19表达和生存的临床特征。中值确定了TM4SF19表达阈值。

利用多变量分析和Cox回归模型生成列线图。这些图使用独立的预后变量来预测1年、5年和10年间隔的生存率。校准分析和校准图确定列线图预测的准确性。预后数据来自Cell文章 [38] 。

3. 结果

3.1. TM4SF19在BLCA中的表达

TM4SF19在大多数癌症中表达增加，包括膀胱癌(BLCA)、乳腺浸润性癌等(图1(a))。然而，它在一些癌症中下降，例如睾丸癌(TGCT)和胸腺癌(THYM)。大多数癌症(包括BLCA)的配对样本中TM4SF19的表达水平有所增加(图1(b))。在BLCA的配对和未配对样本中，TM4SF19的表达与正常样本显着不同(图1(c)和图1(d))。采用ROC分析分析TM4SF19在膀胱尿路上皮癌中对癌组织和正常组织的分化作用。TM4SF19的曲线下面积为0.831 (图1(e))。这些表明TM4SF19在预测肿瘤和正常结果方面具有一定的准确性。结果均具有统计学意义。

TCGA数据库中(a) 未配对和(b) 配对的泛癌样本中TM4SF19的表达。TCGA-BLCA的(c) 未配对和(d) 配对样本中的TM4SF19表达。根据(e) TCGA-BLCA中TM4SF19的表达水平来区分BLCA肿瘤组织和正常组织的诊断ROC曲线。p ≥ 0.05；^*p < 0.05；^**p < 0.01；^***p < 0.001。

Figure 1. Expression and diagnostic value of TM4SF19 in BLCA

图1. TM4SF19在BLCA中的表达及诊断价值

3.2. BLCA中TM4SF19的单基因差异表达分析

经过TM4SF19单基因差异表达分析，我们筛选出1011个符合标准的基因，在标准下，有893个基因强表达(positive logFC)。有118例低表达(negative logFC)。火山图用于描述单基因差异分析结果(图2(a))。我们利用上述1011个基因组构建了不同的蛋白质相互作用网络。我们发现了62个HUB基因(图2(b))。然后将与TM4SF19关系最密切的30个基因用于相关性分析，以生成共表达热图(图2(d))。图2(c)描绘了说明前30个HUB基因和TM4SF19共表达的热图。

(a) 蓝色表示下调基因的表达，红色表示上调基因的表达。(b) 中心基因的PPI网络。(c) 热图显示了hub基因和TM4SF19之间的共表达模式。(d) 通过单基因相关性研究得出与TM4SF19关联性最高的前30个基因。

Figure 2. Single gene differential analysis and correlation analysis of TM4SF19

图2. TM4SF19的单基因差异分析及相关性分析

3.3. BLCA中TM4SF19的通路富集和分析

对TM4SF19和差异基因进行GO富集分析(图3(a)~(c))。TM4SF19相关基因被证明参与表皮发育、角质形成细胞分化、细胞-基质连接、酶抑制剂活性等。随后，进行了KEGG富集分析(图3(d))。结果表明TM4SF19与吞噬体、蛋白多糖在癌症、阿米巴病等方面发挥功能。最后，我们对TM4SF19差异基因和选定的通路进行GSEA分析，结果显示共有22条通路显著富集，即上皮间质转化、同种异体移植排斥、炎症反应等(图3(e)，图3(f))。

3.4. TM4SF19表达与免疫浸润的关系

TM4SF19表达与巨噬细胞、Th1细胞和其他免疫细胞呈正相关，但与NK CD56bright细胞和肥大细胞呈负相关(图4(b)，p < 0.05)。此外，aDC、B细胞、细胞毒性细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、CD56bright细胞、NK CD56dim细胞、T细胞、Tcm、Tem、Tgd中TM4SF19高表达水平和低表达水平组之间的免疫浸润评分存在统计学显着差异。Th2细胞、Th1细胞和TReg (p < 0.05，图4(a))。接下来，我们绘制了每个免疫细胞浸润评分与TM4SF19表达的散点图。图4(c)~(h)中给出了显示显着相关性(p < 0.001)的结果。上述研究结果表明肿瘤的免疫激活状态与TM4SF19的高表达之间存在很强的相关性。

(a)~(d) TM4SF19相关DEG的GO和KEGG富集分析。(e) (f) 使用GESA分析得出TM4SF19-低表达和TM4SF19-高表达之间最显着富集的通路。

Figure 3. The function enrichment analysis of related DEGs of TM4SF19 in BLCA

图3. BLCA中TM4SF19相关DEG的功能富集分析

(a) 比较TM4SF19高组和TM4SF19低组之间24个免疫细胞的富集分数，并使用箱线图显示结果。(b) 棒棒糖图代表24个免疫细胞和TM4SF19之间的相关性。(c)~(h) 散点图显示TM4SF19的表达与巨噬细胞、Th1细胞、Th2细胞、NKCD56dim细胞、中性粒细胞、NKCD56bright细胞浸润程度的关系。p ≥ 0.05；^*p < 0.05；^**p < 0.01；^***p < 0.001。

Figure 4. Immune infiltration analysis of TM4SF19

图4. TM4SF19的免疫浸润分析

3.5. TM4SF19表达与临床病理变量之间的关系

临床基线信息表(表1)是从TCGA数据库的414个BLCA样本中获得的，用于检查TM4SF19表达和临床病理特征。病理NM分期、年龄、性别、BMI、淋巴血管侵犯、吸烟者之间TM4SF19表达与临床数据的相关性无显着变化。尽管如此，TM4SF19的表达因病理T分期、病理分期、种族、组织学分级和亚型而存在显着差异(图5(a)~(l))。

Table 1. The clinical baseline information table about the association between the expression of TM4SF19 and different clinical-pathological characteristics of BLCA patients from the TCGA database

表1. TCGA数据库中BLCA患者TM4SF19表达与不同临床病理特征相关性的临床基线信息表

3.6. TM4SF19与BLCA患者预后的关系

TM4SF19高表达组表现出相对较差的OS率(HR = 1.67, p = 0.001, 图6(c))。DSS (HR = 1.84, p = 0.001)和PFI (HR = 1.57, p = 0.003)的生存结果表明TM4SF19高表达的肿瘤患者预后更差(图6(d)和图6(e)。附录图S1显示了各个亚组的生存分析结果。TM4SF19高表达亚组生存率更差。最后，我们对常见的临床病理因素进行了单变量和多变量Cox回归(图6(a)、图6(b))。TNM分期、病理分期、年龄、淋巴管侵犯和TM4SF19在单变量分析中存在统计学差异。选择具有统计显着性的结果进行进一步研究，从而执行多元Cox回归分析。该分析结果显示，T分期、N分期、年龄和TM4SF19仍具有统计学显着性(p < 0.05)，表明TM4SF19表达升高是BLCA患者的总生存风险的独立危险因素。

TM4SF19表达与(a) T分期、(b) 病理分期、(c) 种族、(d) 组织学分级、(e) 亚型、(f) N分期、(g) M分期、(h) 关系)性别、(i) 年龄、(j) BMI、(k) 淋巴血管侵犯和(l) 吸烟者的相关性，p ≥ 0.05；^*p < 0.05；^**p < 0.01；^***p < 0.001。

Figure 5. In the TCGA-BLCA database, the relationship between the expression of TM4SF19 and clinicopathological factors

图5. TCGA-BLCA数据库中TM4SF19的表达与临床病理因素的关系

基于(a) 单变量和(b) 多变量Cox分析的OS森林图 (c)~(e) BLCA中TM4SF19-low和TM4SF19-high之间OS、DSS和PFI的K-M分析。(f) 用于预测1BLCA的1年、5年和10年OS生存率。(g) 1年、5年和10年OS生存列线图的校准曲线。

Figure 6. Prognostic values of TM4SF19 and construction of prognostic nomogram model

图6. TM4SF19的预后价值和预后列线图模型的构建

3.7. 基于TM4SF19的列线图构建与验证

BLCA患者的预后列线图是使用多变量Cox回归分析得出的。列线图中包含的变量为T分期、N分期、年龄和TM4SF19。所得列线图显示C指数为0.661 (0.637~0.685)，显示出预测患者预后的准确性(图6(f))。之后，我们制作了校准图来测试模型的预测准确性。偏差修正线接近理想曲线(45˚)，投影值与实际值相符(图6(g))。

4. 讨论

TM4SF19是一种新发现的蛋白编码基因，其在肿瘤中的作用及其对肿瘤预后的影响目前尚未有研究报道。本研究通过挖掘分析TCGA数据库中的BLCA转录本数据，发现TM4SF19在BLCA中高表达，并进一步通过GO、KEGG、GSEA分析TM4SF19的功能，以系统了解TM4SF19在BLCA。最终分析显示，TM4SF19高表达可能是BLCA预后不良独立的危险因素。

在TCGA泛癌研究中，我们发现大多数癌症中TM4SF19的表达高于正常样本，这表明TM4SF19是一种可能的促癌分子。另外，在TCGA-BLCA数据库中，诊断ROC曲线结果显示AUC = 0.831，表明TM4SF19的表达对BLCA的诊断效果具有一定的准确性。这些结果表明TM4SF19可能是诊断BLCA的有用分子标记。

通过单基因差异分析和单基因相关分析，共鉴定出62个与TM4SF19功能密切相关的枢纽基因和30个相关性最强的基因。其中包括KRT系列、CXCL、CCL等。其中，角蛋白基因家族与TM4SF19的表达关系尤为密切。角蛋白(KRT)是上皮细胞的细胞骨架蛋白39，在癌细胞侵袭和转移中发挥作用，许多KRT家族成员是癌症诊断或预后指标 [39] [40] [41] [42] 。因此，我们推测TM4SF19可能通过促进角蛋白相关蛋白和角蛋白的功能来发挥促进BLCA的作用。炎症因子，包括C-C基序趋化因子配体(CCL)和C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)，是与TM4SF19相关的HUB基因。研究表明，炎症可调节癌症的形成和对治疗的反应，从而促进或抑制肿瘤进展并对治疗结果产生相反的影响 [43] 。针对CCL或CXCL的治疗可抑制肿瘤侵袭和增殖 [35] 。这些研究表明TM4SF19是膀胱癌患者的潜在治疗靶点。

然后我们对TM4SF19及其相关基因进行GO和KEGG通路富集分析，发现它们与粘着斑、细胞骨架的结构组成、角化包膜、癌症中的蛋白聚糖、溶酶体、上皮间质转化和炎症反应等相关。细胞迁移历来需要通过粘着斑位点、突出延伸和细胞体收缩来粘附基质 [44] 。癌症的扩散取决于细胞迁移失调。当粘着斑蛋白被靶向时，癌细胞对放射、化疗和新的分子疗法非常敏感 [45] 。GSEA分析显示，上皮间质转化和炎症反应信号通路在TM4SF19高表达组中出现丰富，这些通路与肿瘤的生长、转移和侵袭的表型密切相关 [46] [47] ，提示TM4SF19的高表达可以作为预测BLCA患者预后的危险因素。

肿瘤微环境(TME)是具有异质性的，决定着抗肿瘤或肿瘤发生免疫反应 [48] [49] [50] [51] 。免疫逃逸在初始抗肿瘤免疫阶段保护肿瘤细胞免遭肿瘤消除 [52] 。我们的研究表明TM4SF19与巨噬细胞、Th1细胞、Th1细胞、NK CD56dim细胞、中性粒细胞、aDC、Treg和Tgd呈正相关，而与NK CD56bright细胞和Msat细胞呈负相关。实体瘤中的巨噬细胞浸润与大多数恶性肿瘤的不良预后和治疗耐药性有关 [53] 。因此，针对BLCA靶向巨噬细胞的靶向治疗可以有效抑制BLCA的增殖、侵袭和迁移 [54] 。Th2细胞对TME具有矛盾的作用，TME通过释放细胞因子与其他免疫细胞一起活跃 [55] 。先前的研究报告称，Th2会改变免疫反应以促进肿瘤的发展。例如，Th2细胞向Th1细胞的转化发生在小鼠肺移植肿瘤缓解期间。TME中Th2细胞的主导地位与不良预后相关 [56] 。此外，研究还报道，Th2细胞进行的免疫反应与多种肿瘤的肿瘤进展有关 [57] [58] [59] 。这也提示TM4SF19可能促进TME介导的Th2细胞型免疫应答介导的免疫逃逸，促进BLCA肿瘤的发生和发展。上述结果提示TM4SF19表达增加能够抑制BLCA患者的抗肿瘤免疫反应。

最后，我们研究了TM4SF19和BLCA患者之间临床病理因素的相关性，并构建了列线图作为临床医生的预后工具。BLCA中TM4SF19的高表达与较差的临床病理特征相关，包括亚型、组织学分期等。在生存分析中，与TM4SF19低表达的患者相比，TM4SF19高表达的患者的OS、PFI和DSS显着缩短。在多个亚组中，TM4SF19的高表达也与不良预后相关。通过校准图分析了列线图的准确性，显示1年、5年和10年的实际OS值与预测OS值之间具有良好的一致性。因此，我们的列线图可能是未来临床医生一种有价值的新预后方法。

总之，我们的研究结果揭示了TM4SF19和BLCA之间的关系，但存在一些局限性。首先，本研究中用作对照的正常样本和肿瘤样本的数量存在较大差异，因此需要进行额外的研究来填补样本量的空白。此外，这些发现缺乏实验验证，未来还需要更多的实验来进一步验证TM4SF19在BLCA患者中的作用机制。

附录

(a)~(o) BLCATM4SF19-低和TM4SF19-高之间临床病理亚组的OS的K-M分析。

Figure Sl. Prognostic values of TM4SF19 expression in BLCA patients

图S1. BLCA患者中TM4SF19表达的预后价值

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]