Notch信号通路相关的非编码RNA在骨肉瘤中的研究进展

Research Progress of Non-Coding RNA Related to Notch Signaling Pathway in Osteosarcoma

摘要: 骨肉瘤是临床最常见的恶性成骨性肿瘤之一，具有发病率高、治愈率低的特点。Notch信号通路在调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、血管生成，维持稳态等方面起重要作用，可能是预防骨肉瘤侵袭和转移的新型治疗策略。有研究证实非编码RNA如miRNA、lncRNA、circRNA等通过靶向Notch信号通路调控骨肉瘤的发生和发展，为治疗骨肉瘤提供一定的理论基础。本文章综述了Notch信号通路的组成，并重点阐述了相关非编码RNA靶向Notch信号通路在OS中的作用，对骨肉瘤的临床治疗和预后具有重要的临床意义。

Abstract: Osteosarcoma is one of the most common malignant osteogenic tumors in clinic. It has the charac-teristics of high incidence rate and low cure rate. Notch signaling pathway plays an important role in regulating osteosarcoma cell proliferation, apoptosis, invasion, migration, angiogenesis and maintaining homeostasis. It may be a new therapeutic strategy to prevent osteosarcoma invasion and metastasis. Some studies have confirmed that noncoding RNAs such as miRNA, lncRNA and circRNA regulate the occurrence and development of osteosarcoma by targeting Notch signal path-way, which provides a theoretical basis for the treatment of osteosarcoma. This article reviews the composition of Notch signaling pathway, and focuses on the role of related non coding RNA targeted Notch signaling pathway in OS, which has important clinical significance for the clinical treatment and prognosis of osteosarcoma.

1. 引言

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是临床最常见的恶性成骨性肿瘤之一，可以发生于任何年龄段的人，但大多数发生在儿童、青少年和青壮年 [1] [2] 。根据国家癌症研究所以人口为基础的监测、流行病学调查得出最终结果，约53%的骨肉瘤患者年龄 < 24岁，并且男孩比女孩多见，25~59岁患者占28%，剩下19%的骨肉瘤患者是60岁以上老年人。全球每年OS的发病率为3.4/百万人，相对于年龄呈双峰分布模式：在10~14岁达到第一次高峰，在60岁后出现第二次高峰。在20世纪70年代引入辅助化疗之前，骨肉瘤患者的标准治疗方法是截肢 [3] [4] 。到1990年，随着新辅助化疗和外科手术技术的发展，OS患者的5年生存率从20%提高到约55%至70% [5] 。到20世纪90年代，基因治疗成为研究热点，这也为OS患者的治疗提供了新的见解。骨肉瘤患者的预后和生活质量在过去的几十年里得到了显著的改善，20世纪70年代初，应用大剂量甲氨蝶呤、长春新碱和亚叶酸等手术辅助化疗把患者的存活率提高了3倍，然而，转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率在过去30年中几乎没有变化，因此该疾病的分子信号机制仍有待深入研究 [6] 。目前，许多研究已经证实Notch、Wnt、Hedgehog、PI3/Akt等信号通路在骨肉瘤的生理和病理过程中起重要作用 [7] ，Notch通路机制在不断被揭示，目前已成为OS基因治疗研究的热点之一，参与骨肉瘤的增殖、凋亡以及侵袭迁移，促使骨肉瘤的耐药和再生，在骨肉瘤发生和发展过程中扮演重要角色 [8] 。

Notch通路是多细胞生物发育过程中进化保守的信号通路，在骨肉瘤中发挥重要作用，影响多种细胞过程，包括决定细胞命运，调控OS细胞增殖、凋亡、迁移、血管生成，维持稳态等 [9] 。自1917年Morgan在Notch果蝇突变体中首次描述Noch信号以来，人们一直在努力了解它在决定细胞命运、增殖、凋亡和分化中的多种功能 [10] 。在果蝇遗传学的早期阶段之后，也就是20世纪80年代，Notch信号通路的研究进入了分子时代。Michael Young和Spyros Artavanis-Tsakonas的研究小组 [11] 克隆了果蝇Notch受体基因，通过苍蝇遗传学和生物化学的结合进行研究，这是Notch信号研究中里程碑式的突破。在这些研究奠定的基础上，有研究通过动物模型阐明了Notch信号通路与骨肉瘤的发生发展存在着密切关系，在这篇综述中，我们简要介绍了Notch信号通路及其信号转导机制，并重点关注了Notch信号通路在骨肉瘤中的重要作用。

2. Notch信号通路组成及表达

Notch信号通路包括Notch配体、受体、负性和正性修饰物以及Notch靶向转录因子。在哺乳动物中，有4个Notch受体(Notch1-4)、5个Notch配体(JAG1、2、DLL1、3、4)、核转录因子 [12] [13] 。Notch受体是一个由异源二聚体组成的单一跨膜分子，其配体也是一个跨膜分子。与大多数受体、配体有所不同的是，Notch受体和Notch配体都是膜蛋白，通过相邻细胞通信。Notch受体在内质网中产生，当Notch受体与其配体结合时，Notch信号被激活，Notch受体作为异二聚体靶向到细胞膜表面，改变了其特定配体激活Notch信号的能力，与邻近细胞呈现的配体结合而被激活。Notch受体在到达质膜的过程中被高尔基体内的furin样转化酶处理(S1裂解)，形成成熟的Notch受体并迁移至细胞的表面，再被ADAM金属蛋白酶的配体相互作用处理(S2裂解)，受体被γ-分泌酶复合体水解(S3裂解)，最终产生Notch (NICD)的胞内结构域。Notch胞内结构域(NICD)是Notch受体激活的最终产物，一旦NICD被γ-分泌酶释放，它就会易位到细胞核中，调控包含DNA结合蛋白CBF1/RBPjk/Su(H)/Lag1 (CSL)的转录复合物。在细胞核中，NICD与DNA结合蛋白CSL和MAML形成三聚体复合物，将CSL从阻遏物转化为激活因子，并启动Notch下游靶基因的转录；在NICD缺失的情况下，CSL也可以与转录辅抑制蛋白结合来抑制基因表达。这种核心信号转导途径用于大多数Notch依赖的过程，因此被称为“典型”途径 [14] 。一项对12例骨肉瘤患者的队列研究显示，Notch 1信号通路在肿瘤组织中显著上调，Notch (NICD)的胞内结构域和Notch靶基因Hes1的高表达与化疗反应不良相关。但Notch 2和Notch 3在骨肉瘤中的表达及其临床意义尚未见报道。Notch信号还可以在信号级联的许多不同阶段被修饰，作用于Notch受体本身、它们的配体、配体介导的蛋白质切割或随后的NICD核转位和激活 [15] [16] 。值得一提的是，OS发病机制与Notch信号传导激活相关，近年来已经有许多研究和动物模型阐明了Notch信号的生理和病理作用，包括OS的体内模型，已经表明Notch受体(Notch-1、Notch-2)、配体和细胞内信号传导分子(hey-1、hes-1)的水平增加与OS转移能力有关 [17] ；在体外研究中，Tanaka等人 [18] 研究发现Notch2和Jagged1在OS标本中高表达，OS的侵袭和转移能力受到Notch相关基因和蛋白质水平的显著影响，其决定OS病例的存活，抑制该途径可能是预防OS发展的有益方法 [19] 。总之，Notch信号通路在促进骨肉瘤中起重要作用，并且其异常激活而不是失活加速了恶性进展。因此，检测其表达水平和功能状态对预测骨肉瘤的发生发展和预后具有重要意义。

3. miRNA通过靶向Notch信号通路在OS中的表达与作用

Notch信号通路是进化过程中高度保守的细胞信号转导系统，调控细胞增殖、凋亡和分化，在胚胎发育、机体维持动态平衡、免疫调节和疾病发生等生理病理过程中发挥重要作用 [20] [21] 。目前，许多miRNAs已被证实在骨肉瘤组织和细胞中有差异表达，并且参与了OS的发展 [22] ，例如，作为研究充分的miRNAs，miR-34家族成员(miR-34a、miR-34b和miR-34c)具有较高的序列相似性 [23] ，Yan等人的研究 [24] 首次报道了miR-34a过表达抑制骨肉瘤细胞的体内外生长和迁移，他们推测miR-34a靶基因可能介导miR-34a诱导的骨肉瘤肿瘤生长和迁移的抑制。由miR-34a衍生的miR-34a-5p被发现可以抑制细胞的侵袭和迁移，miR-34a-5p通过抑制Notch通路的配体Delta-like配体1 (DLL1)基因来促进OS的多重化疗耐药，与OS的化疗耐药呈负相关 [25] [26] 。随后，Tian等人 [27] 通过研究miR-34b与OS的危险性及迁移状态，预测miR-34b可能是一种新的OS生物标志物和潜在的治疗靶点。但是我们还需要进一步深入了解miR-34家族靶向Notch通路的作用机制以提供OS的治疗策略。

Pan等人 [28] 的研究认为过表达miR-340通过下调CTNNB1 (原癌基因)灭活Notch信号通路，从而抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭，促进OS细胞的凋亡。因此得出结论，miR-340是保护OS所必需的。有研究检测了OS样本、配对非肿瘤组织及骨肉瘤细胞系中miR-1296-5p的表达，发现OS样本中的miR-1296-5p水平明显低于相应的非癌组织，通过功能获得分析证实Notch2信使RNA水平与miR-1296-5p水平呈负相关，miR-1296-5p反向调节OS细胞中的Notch2，miR-1296-5p过表达抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭 [29] 。miR-26a过表达也同样抑制OS细胞的生长，不同之处是miR-26a直接靶向Notch配体之一Jagged1，其肿瘤抑制作用是通过抑制Jagged1/Notch信号通路介导的 [30] 。

也有miRNA的过表达会加速OS的进展，如Cai等人 [31] 进行了一系列的挽救实验，研究证实Notch3是miRNA-206的靶基因，miRNA-206的过表达会通过靶向Notch3加速OS细胞的增殖和迁移，从而加速OS的恶性进展。

Kyu Yeoun Won等人 [32] 提出miRNA-199b-5p参与了骨肉瘤中的Notch信号通路，然而，miR-199b-5p在骨肉瘤中Notch信号通路中的作用尚未被研究。为了进一步探索miR-199b-5p在人骨肉瘤细胞中的作用，Zeng等人 [33] 首次提供了令人信服的证据，他们的研究证实miR-199b-5p表达的增加可能在人骨肉瘤的侵袭性进展和不良预后中发挥关键作用。虽然已经在该领域取得了巨大进展，但仍面临着许多挑战。

4. Notch信号通路相关lncRNA在OS中的表达与作用

大多数lncRNA本身似乎并不像信号转导分子那么重要，然而，它们在调节信号通路上是至关重要的 [34] [35] 。目前在骨肉瘤中已经鉴定出几种遗传缺陷，其中包括p53和Rb肿瘤抑制基因的失调、非整倍性和染色体排列调节中的巨大干扰，这表明DNA修复机制中的主要缺陷可能是骨肉瘤的根本原因。与此同时，大量的研究表明，在骨肉瘤临床标本和已建立的细胞系中，长链非编码RNA (lncRNA)存在异常调控，基于lncRNA在DNA完整性监测中的重要作用，这些转录物被认为是骨肉瘤发病机制的重要因素。据报道，lncRNAs可以作为microRNAs的竞争性内源性RNA (ceRNAs)，可以动过海绵效应将miRNA吸附到LncRNA的长链上发挥调控作用，从而调控骨肉瘤的发生发展。Chen等人 [36] 体外构建了过表达lncRNA MEG3的骨肉瘤细胞，在lncRNA MEG3过表达的骨肉瘤细胞中，Notch信号通路受到抑制，过表达lncRNA MEG3可显著降低骨肉瘤细胞中Jagged1、Notch1和NICD1的蛋白表达，并显著增加OS细胞中凋亡相关蛋白的表达，从而有效抑制增殖，促进骨肉瘤细胞凋亡。另有研究发现lncRNACEBPA-AS1和NCOR2 (核受体辅抑制因子2)在OS组织和细胞中均弱表达，lncRNACEBPA-AS1通过上调miR-10b-5p介导的NCOR2，抑制Notch信号通路，抑制增殖和迁移，加速OS细胞凋亡 [37] 。这些发现提示lncRNA MEG3和lncRNACEBPA-AS1都可以通过抑制Notch信号通路，抑制骨肉瘤的进展，为今后OS的治疗研究提供新的思路。Zhou等人 [38] 一项关于Notch2受体的研究证实阻断细胞周期可以影响OS的生物学功能，他们发现通过阻断G0/G1期的细胞周期进程下调LncRNA SNHG12，削弱细胞的侵袭和迁移能力来抑制细胞增殖。进一步研究发现LncRNA SNHG12可以通过激活Notch2促进骨肉瘤的肿瘤发生和迁移。lncRNA在基因表达调控中的巨大多效性作用以及它们对DNA修复机制和基因组完整性的影响表明它们的失调可以显著地影响癌发生。lncRNA在基因表达调控中的一种重要作用模式是它们作为miRNA的竞争性内源RNA (ceRNA)的功能，以降低miRNA的生物利用度，因此增加其靶mRNA的水平。以上研究表明lncRNA与骨肉瘤的生物学行为有着密切的联系，通过研究其作用机制为骨肉瘤的精准治疗提供了依据。

5. Notch信号通路相关circRNA在OS中的表达与作用

环状RNA (circRNA)是一种新型的内源性非编码RNA，在骨肉瘤的进展过程中，circRNA可以作为miRNA海绵和转录调控因子，调节靶miRNA和蛋白的表达，从而调节骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移 [39] ，沉默hsa_circRNA_0008035通过加速miR-375对Notch信号通路具有抑制作用，对OS的生长和迁移也具有抑制作用 [39] [40] ，但具体机制仍不清楚，有待我们进一步探索。

Notch信号通路和MAPK信号通路都可以单独调控骨肉瘤，近年来有一项研究表明Notch信号通路通过调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的活性来调控肿瘤细胞的生物学功能，Qin等人 [41] [42] 认为DAPT (γ分泌酶抑制剂)可以通过抑制Notch活性来降低Erk磷酸化水平，从而降低小鼠骨肉瘤的体内外增殖和迁移。使用DAPT治疗骨肉瘤，ALDH (醛脱氢酶)活性和Notch信号通路的表达会显著降低，因此他们认为Notch信号通路与OS细胞中ALDH的活性和迁移行为的增加相关，DAPT可能是具有高迁移潜能的OS细胞特异性治疗靶点 [43] [44] 。因此，抑制Notch激活导致Erk通路磷酸化下调可作为临床治疗的潜在途径，为改善骨肉瘤预后提供了新思路。这些研究表明Notch信号在骨肉瘤的起始和进展中起着主导作用。

Notch通路是肿瘤治疗的潜在靶标，积极参与肿瘤生长、转移、化学抗性、肿瘤免疫和其他功能。目前的治疗策略主要是抑制Notch途径以发挥抗肿瘤作用，主要有两种类型的Notch抑制剂：选择性和非选择性抑制剂。选择性抑制剂包括反义RNA、干扰RNA和单克隆抗体的应用，而非选择性抑制剂包括配体阻断剂、γ-分泌抑制剂和一些天然化合物。选择性抑制剂特异性强，副作用小，不易诱导耐药性，而非选择性抑制剂毒性较大。然而，考虑到癌症中Notch途径的多样性，这些抑制剂在某些情况下具有更大的临床价值。这些结果为以Notch信号通路为靶点的骨肉瘤治疗提供了新的思路，具有一定的应用价值和广阔的应用前景。在治疗上靶向Notch途径通常被认为是复杂的，然而，集中于抑制该途径的临床试验已经证明了在骨肉瘤治疗中的显著功效。Notch通路为骨肉瘤患者的治疗提供了一个有价值的分子靶点，特别是在具有化疗耐药性和远处转移的晚期疾病患者中，然而，在靶向Notch信号通路的骨肉瘤疗法的临床应用中存在某些挑战。

总之，Notch通路的研究日益受到重视，并且也在一些领域有所成就，许多非编码RNA通过靶向Notch通路调控骨肉瘤的研究已经证实，Notch信号通路在调节OS细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移方面发挥重要作用，但Notch信号促进肿瘤发生的下游机制仍有待揭示，而且还有许多治疗靶点未被研究明确，有待于在不久的将来进一步探索。

参考文献