外泌体来源的miRNA在结直肠癌中的作用

Role of Exosome-Derived miRNA in Colorectal Cancer

摘要: 外泌体是由原核细胞和真核细胞主动向外释放的脂质双分子层囊泡样结构，可携带多种特异的生物活性分子如蛋白质、脂质、miRNA和lncRNA等，进入相应的靶细胞，参与调控细胞的生理及病理功能。外泌体是将miRNA和其他活性物质运输到周围细胞的容器，外泌体介导的miRNA可参与结直肠癌的发生、侵袭和转移，并在结直肠癌诊断、预后和治疗过程中扮演重要角色。本文就外泌体来源的miRNA在结直肠癌发生发展过程中的作用、诊断、预后评估及治疗中的相关研究进展进行综述。

Abstract: Exosomes are lipid bilayer vesicle-like structures actively released by prokaryotic cells and eukar-yotic cells. They can carry a variety of specific biologically active molecules such as proteins, lipids, miRNA, and lncRNA into the corresponding target cells, involved in regulating the physiological and pathological functions of cells. Exosomes are containers that transport miRNA and other active sub-stances to surrounding cells. Exosome-mediated miRNA can be involved in the occurrence, invasion and metastasis of colorectal cancer, and play an important role in the diagnosis, prognosis and treatment of colorectal cancer. This article reviews the related research progress on the role of exo-somal miRNA in the occurrence and development of colorectal cancer, diagnosis, prognosis evalua-tion and treatment.

1. 引言

结直肠癌是最多发的恶性肿瘤之一，全球结直肠癌发病率排第3位，死亡率位居第2位，严重威胁了上百万人的生命健康 [1]。在我国，随着经济发展对人们生活方式的改变及人口老龄化的影响，结直肠癌发病率呈持续增长态势 [2]。外泌体是直径范围约为40~160 nm的具有磷脂双分子层结构的囊泡样小体，内含母体细胞来源的多种生物活性分子，包括蛋白质、脂质、DNA、RNA、mRNA、lncRNA及微小RNA (microRNA, miRNA)，作为近距离和远距离细胞间通讯的媒介参与细胞之间的信号传递，调节细胞的生理和病理功能 [3]。miRNA是长度约为17~24 nt的小非编码RNA，它们广泛参与mRNA的转录后调节过程 [4]。已知miRNA可以靶向大多数mRNA，使它们能够在各种生理和发育过程中具有重要的调节作用，miRNA介导的基因表达控制作用在细胞对环境胁迫如饥饿、缺氧、氧化应激和DNA损伤的反应中至关重要，从而与结直肠癌等疾病密切相关 [5]。近几年研究发现，肿瘤外泌体来源的miRNA可以通过细胞间通讯影响结直肠癌的发展，同时可作为生物标志物在癌症诊断和预后以及治疗的应用中产生深远影响，提高诊断的准确性，丰富靶向治疗的手段 [6]。越来越多的学者研究证明，外泌体miRNA与结直肠癌进展机制直接相关，并取得了重要突破 [7]。

2. 外泌体的研究背景

尽管在上世纪60年代后期首次描述了哺乳动物组织或体液中细胞周围存在囊泡，“外泌体”一词1981年才由Tram等 [8] 提出，但通用术语细胞外囊泡(extracellular vehicles, EVs)直到2011年才被提出来，用于定义所有细胞外的脂质双分子层封闭结构。EVs可以通过细胞质膜的向外出芽或通过细胞内吞运输途径形成，该途径涉及晚期多囊泡体(multivesicularbody, MVB)与质膜的融合，融合过程导致MVB包裹的腔内小囊泡(intraluminal vesicles, ILVs)向细胞外释放，产生一种与ILVs大小相同(直径 < 200 nm)的EVs亚型，称为外泌体。外泌体是EVs一个重要的亚群，直径普遍在40~160 nm左右，几乎被所有已知细胞分泌，广泛存在于各种体液中，包括血清、尿液、脑脊液液、唾液和母乳。最初的观点认为，外泌体的分泌过程是细胞消除不必要蛋白质等胞内废物的一种机制 [9] [10]。然而，后来的研究结果表明，外泌体可以在细胞间通讯中发挥作用 [11] [12]，特别是在免疫反应和癌症中。其中，癌细胞分泌的外泌体至少是正常细胞的10倍，外泌体释放的内容物具有特异性反映了分泌细胞的各个方面，具有作为诊断标准物的潜力，同时肿瘤衍生的外泌体被证明可以通过运输生长因子、趋化因子、特别是通过miRNA来促进细胞间的交流，肿瘤细胞来源miRNA可通过外泌体与受体细胞膜之间的相互作用实现信号传递影响癌症进展 [13]。

3. 外泌体miRNA的生物学特征

外泌体携带的miRNA属于小非编码单链RNA，通常不具备编码蛋白质的能力，miRNA可以通过外泌体包裹使其免受体内核糖核酸酶的影响。miRNA的生物发生始于细胞核，DNA被RNA聚合酶II转录以产生初级miRNA。这些初级miRNA首先被转录为较长分子的一部分，长度可达几千碱基，这些分子在细胞核中被双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha处理成70~100 nt的发夹形RNA前体，然后通过输出蛋白5从细胞核运输到细胞质中，在那里它们被称为Dicer的双链特异性核糖核酸酶进行进一步处理，之后双链miRNA转化为成熟的单链miRNA，成熟的miRNA通过不同的模式被分选进入外泌体 [14]。另外，研究者发现，外泌体miRNA的生物发生、释放和摄取过程可能涉及运输所需的内体分选复合体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)和相关蛋白质的参与 [15]。现有研究表明，外泌体内的miRNA可以作为癌基因或者癌症中的肿瘤抑制基因，参与调节细胞表型、细胞因子表达和分泌的变化 [16]，引起炎症和免疫及导致肿瘤恶化 [17]。

外泌体运输miRNA有三种形式，前两种方式是外泌体通过与质膜融合或内吞作用将其携带的miRNA转移至受体细胞内，从而在受体细胞内发挥重要的生物学作用。第三种是外泌体携带miRNA内化进入受体细胞，之后有两种结局，第一种结局是一些被吞没的外泌体可能合并到核内体中并经历胞吞作用，这将使外泌体miRNA穿过受体细胞并释放到邻近细胞中；第二种结局是由吞噬的外泌体融合形成的核内体靶向溶酶体并进行降解 [18]。由于外泌体广泛参与miRNA等物质的运输，外泌体来源的miRNA被认为是不同细胞之间相互作用的重要活性物质。

4. 外泌体miRNA在结直肠癌发展中的作用

研究表明，外泌体是细胞主动分泌产生的，在特定信号的调控下外泌体选择性包裹特定miRNA，这些活性成分在外泌体携带下靶向受体细胞进入细胞质后发挥作用 [19]。外泌体miRNA通常靶向血管细胞、间充质干细胞、肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、炎性细胞等，而以上肿瘤相关细胞可与细胞外基质一起共同构成肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)。TME是围绕肿瘤的交互式细胞环境，其主要功能是建立支持肿瘤发生的细胞通讯途径，外泌体内容物为细胞与TME之间重要的通讯物质，其中外泌体来源的miRNA至关重要。消化系统组织血运丰富，肿瘤易发生远处转移和复发是其愈后不良的主要因素。如结直肠癌易沿门静脉系统转移至肝脏，癌细胞通过血液循环从起源扩散到远处的器官，其转移的过程并不是随机的而是具有一定的靶向性。目前研究认为，癌细胞会在外泌体miRNA的指导下优先寻找特定的器官，并在那里的微环境“筑巢”，这种寻找目的地的行为类似“种子”和“土壤”的相互作用，种子在到达土壤之前通过给“土壤”施肥，从而为肿瘤增殖转移做准备，外泌体来源的miRNA便是肿瘤微环境土壤的重要“肥料” [20]。

越来越多的证据表明，癌细胞通过外泌体与TME的串扰诱导免疫抑制、促进血管生成等机制参与调节结直肠癌增殖侵袭和转移的过程 [21]。Zhao等 [22] 通过测序分析发现，miR-934在结直肠癌外泌体中异常过表达，特别是在结直肠癌肝转移过程中，与患者预后不良有关，发现结直肠癌细胞来源的外泌体miR-934通过下调PTEN蛋白表达和激活PI3K/AKT信号通路诱导M2巨噬细胞极化，极化的M2巨噬细胞可以通过分泌CXCL13激活结直肠癌细胞中的CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934正反馈环路，来诱导转移前生态位的形成并促进结直肠癌肝转移，此过程miR-934主要包裹在外泌体中，提示外泌体存在暂未阐明的分选机制。Wang等 [23] 发现，多种直肠癌外泌体来源miRNA (miR-25-3p、miR-130b-3p、miR-425-5p)通过CXCL12/CXCR4轴的激活上调，靶向到巨噬细胞，这些外泌体来源的miRNA通过激活PI3K/Akt信号通路调节PTEN蛋白来诱导巨噬细胞的M2极化，增强上皮间充质转化和分泌血管内皮生长因子，从而改变TME促进结直肠癌增殖转移。

Zeng等 [24] 同样发现，结直肠癌细胞分泌的外泌体来源miR-25-3p可以作用到血管内皮细胞，通过靶向Krüppel样因子2和Krüppel样因子4来破坏内皮屏障的完整性，促进血管通透性增加并诱导血管生成，从而形成转移前生态位，促进结直肠癌转移。Shang等 [25] 发现，结直肠癌细胞通过过度表达外泌体来源miR-183-5p来抑制FOXO1从而促进血管内皮细胞的增殖、迁移，促进血管形成。

值得注意的是，Yan等 [26] 发现，结直肠癌细胞来源的外泌体miR-548c-5p通过miR-548c-5p/HIF1A/CDC42轴抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。显然，外泌体miRNA可以发挥双重作用，它们可能参与肿瘤抑制或促进。综上，研究外泌体来源的miRNA在结直肠癌中的调控过程有助于探究结直肠癌发展的详细机制，为结直肠癌的探索提供新思路。

5. 外泌体miRNA在结直肠癌诊断和预后评估中的价值

癌症具有广泛的异质性和多种亚型，由于恶性细胞的克隆性进化，使识别独特的靶点和根除所有肿瘤细胞变得复杂。一个悬而未决的问题是如何提高癌症特异性诊断标志物的效率和准确性。在发现细胞外泌体miRNA的作用之后，特别是在对肿瘤细胞外泌体miRNA的深入研究之后，发现外泌体来源肿瘤细胞特异性miRNA具有更好的完整性和检测准确性 [27]。外泌体miRNA根据其来源细胞的不同具有异质性，有图谱研究表明，不同细胞来源的外泌体包含独特的mRNAs和miRNAs表达谱，实验发现，结直肠癌患者血液中分离的部分外泌体miRNA与健康对照组之间相比有明显差异，其中显著差异表达的外泌体来源miRNA是临床诊断的潜在标志物 [28]。

Karimi等 [29] 研究发现，与正常对照组相比，结直肠癌患者血清样本中外泌体来源的miR-23a和miR-301a的表达量较高。数据分析表明，通过检查外泌体miR-301a和miR-23a的含量能够将结直肠癌患者与正常受试者区分开来，研究结果为外泌体来源的miR-301a和miR-23a在结直肠癌发展中可作为早期检测的非侵入性生物诊断标志物提供了证据。Sun等 [30] 进一步研究发现，血清miR-122在结直肠患者的组织中明显过表达，升高的血清miR-122主要是外泌体来源由肿瘤细胞衍生的。数据分析发现，血清外泌体miR-122的表达量可以区分结直肠癌肝脏转移患者与健康对照组和无肝转移患者，通过单因素和多因素Logistic回归结果显示，循环外泌体miR-122表达较高的结直肠癌患者预后不良，证明了外周血中外泌体miR-122可以预测结直肠癌患者的预后。Shi等 [31] 在另一项研究中鉴定了结直肠癌患者血清中的多种外泌体miRNA，发现循环外泌体来源的miR-126、miR-1290、miR-23a和miR-940具有较高的诊断价值，可在早期将结直肠癌患者与健康对照组区分开，首次证明了无论细胞内miRNA表达如何，结直肠癌细胞都可以相对稳定地分泌外泌体miRNA到细胞外环境中。因此，与血清游离miRNA相比，血清外泌体来源miRNA更适合诊断结直肠癌和评估患者的预后。

目前为止，结直肠癌传统检查手段通常通过结肠镜检查、测量癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)水平、乙状结肠镜检查、粪便DNA检测和septin9基因甲基化血液检测。CEA是一种已公认的结直肠癌生物标志物，然而，它在敏感性和特异性方面仍然有限；内镜检查是结直肠癌筛查的金标准，但肠镜筛查的依从性低舒适性差，对患者来说属于侵入性检查，因此迫切需要研究新的结直肠癌诊断标志物 [32]。上述结果表明，外泌体miRNA可作为癌症诊断、筛查和治疗监测的前瞻性生物标志物 [33]，通过血液外泌体miRNA诊断及评估预后的方法又被称为“液体活检”的新概念 [34]。与组织活检相比，液体活检技术可以更好地克服肿瘤异质性，便于重复检测，研究基于外泌体来源miRNA的液体活检可以提高结直肠癌诊断的准确性，满足患者肿瘤筛查无创高效的临床需求。

6. 外泌体miRNA在结直肠癌治疗中的应用

外泌体miRNA除了具有诊断潜力外，还具有成为癌症新治疗方法选择的潜在特性。癌细胞需要调节其微环境，以促进生长和进一步转化，这种调节可能包括癌症相关细胞和刺激因子的募集。这些相互作用已被证明是由外泌体miRNA介导的。因此，靶向基于外泌体来源miRNA的信息沟通机制可以作为一种新的治疗策略。

6.1. 抑制外泌体miRNA释放

根据上述的研究，肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的外泌体miRNA，外泌体能够携带致瘤或促瘤性miRNA并在细胞之间转移，且被证实异常表达的外泌体miRNA和肿瘤进展相关。因此，将高水平的循环外泌体及其携带的miRNA修饰到正常水平，是一种可行的治疗方法 [35]。如Kosaka等 [36] 研究发现，GW4869是一种有效的、细胞渗透的、特异性的、非竞争性的中性鞘磷脂酶的抑制剂，外泌体的分泌过程受中性鞘磷脂酶调节并被GW4869抑制，GW4869可以减少外泌体miRNA的分泌。同时Wang等 [37] 实验证明，基于GW4869的靶向治疗有效地降低了小鼠体内肿瘤转移的发生，通过研究结直肠癌细胞衍生的外泌体，发现GW4869处理组结直肠癌细胞生长被明显抑制。证明了抑制外泌体miRNA分泌的治疗方案具有高的研究价值。

Kosgodage等 [38] 发现，大麻二酚是一种来自大麻苜蓿的植物大麻素，是一种具有抗炎抗氧化和抗肿瘤增殖活性的抗焦虑剂。研究证明，大麻二酚可以通过抑制多种癌细胞的外泌体miRNA释放来抑制癌细胞增殖，并使癌细胞对化疗敏感。另有研究发现，靶向ESCRT复合体的药物也可用于抑制肿瘤外泌体的分泌以减少外泌体来源致病性miRNA的释放，但需要靶向ESCRT复合体的多种组分及其辅助蛋白才能发挥作用 [39]。因此，研究靶向药物以调节外泌体来源miRNA释放可作为结直肠癌治疗的新选择。

6.2. 外泌体miRNA的免疫疗法

目前，外泌体miRNA因其调节免疫功能的能力引起了人们的兴趣，特别是其与树突状细胞(dendritic cell, DC)的相互作用最受关注。基于DC的免疫疗法是癌症免疫疗法中使用最广泛的方法之一，人们认为，各种策略可以使DC具有肿瘤抗原触发免疫反应，肿瘤细胞来源的外泌体miRNA可能是实现这一目的有效策略。Asadirad等 [40] 指出，发现外泌体miR-155在DC成熟和白细胞介素-12生产中起着重要作用，研究提示利用丰富的肿瘤外泌体来源的miR-155诱导的DC对CT26细胞系的结直肠肿瘤小鼠模型具有调节抗肿瘤作用。因此，这种类型的癌症免疫疗法可以作为控制肿瘤生长和提高结直肠癌动物存活率的有效方法之一，但其在人类的临床应用有待研究。另外，Guo等 [41] 研究发现，热休克蛋白(heat shock protein, HSP)同样是外泌体的重要成分，作为应激诱导的分子伴侣，可以通过调节白细胞介素来刺激免疫功能，来自热应激肿瘤细胞的外泌体含有丰富的HSP，推测可与部分外泌体miRNA协同诱导抗肿瘤免疫反应。可见，外泌体来源的miRNA在抗肿瘤免疫方面发挥至关重要的作用，因此外泌体miRNA可以被认为是纳米级新型癌症疫苗，有广泛的开发潜力。

7. 问题与展望

外泌体miRNA是一个相对较新的研究领域，基于它们在肿瘤生物学中的多方面作用，以及它们作为癌症诊断工具的观点，外泌体miRNA已经引起了人们的广泛兴趣。外泌体miRNA具有通过在不同体液中循环来影响邻近肿瘤细胞以及远处肿瘤和正常细胞的能力。结直肠癌外泌体miRNA通过和TME的相互作用，参与了结直肠癌增殖迁移等重要过程，促进了肿瘤血管生存，为肿瘤转移提供了有利条件，有效调节了肿瘤免疫应答。除了肿瘤促进作用外，外泌体miRNA的高稳定性还被发现可作为潜在的诊断预后生物标志物，成为肿瘤治疗的新研究方向。预计这些方法将改善未来的癌症护理并促成更好的治疗结果。

尽管迄今为止进行的几项研究已经成功地将外泌体miRNA用于癌症诊断和治疗，但仍然面对大量挑战，首当其冲是外泌体分离的纯度问题。目前，分离外泌体的金标准依然是差速离心法，但其分离产物实际是外泌体及微囊泡的混合物，尤其是血液中的外泌体，同时不同的实验室正在使用各种不同技术来分离外泌体，因此它们的功效和敏感性可能会有所不同，并影响最终实验结果，这可能会导致使用外泌体货物作为诊断工具的方法出现问题。为此可以联合传统检测手段如CEA检测，可采用多组学分析同时检测多种外泌体生物标志物如lncRNA、外泌体蛋白等作为CEA检测的潜在补充方法，提高检测敏感性，但需要进行更多具有更大样本量的比较实验来进一步解释这一问题。外泌体miRNA在癌症治疗中也有一些不尽如人意的表现：天然外泌体miRNA会因为被阻挡在一些主要器官如肝脏或脾脏而作用减弱，来自肿瘤细胞或免疫细胞的由天然外泌体miRNA引起的抗癌免疫反应不够强等问题仍需要进一步的临床研究。

综上所述，外泌体miRNA的应用充满机遇和挑战，结直肠癌外泌体来源miRNA为阐明结直肠癌调控机制提供了新的蓝图，外泌体miRNA作为新型的结直肠癌诊断标志物在医药领域有巨大的价值和潜力。血清中外泌体miRNA的检测有望推进结直肠癌早期液体活检的新诊断方向，研究外泌体miRNA的发展有助于实现结直肠癌的靶向精准治疗，外泌体来源的miRNA在结直肠癌的应用前景未来可期。

基金项目

国家自然科学基金项目(编号：81871956)。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail], [e-mail]