摘要: 以120份不同甘薯品种试管苗为材料，利用单一RT-PCR和基因芯片两种技术进行病毒检测比较研究。单一RT-PCR结果表明，供试样品中甘薯曲叶病毒SPLCV的阳性率最高，达62.5%；依次是甘薯褪绿矮化病毒SPCSV、甘薯羽状斑驳病毒SPFMV、甘薯G病毒SPVG以及潜隐病毒SPLV。基因芯片在SPLCV、SPCSV、SPFMV及SPVG等4种病毒的检出率结果显著低于单一RT-PCR。因此，单一RT-PCR较适用于试管苗病毒检测，基因芯片快速、便捷、高通量，但是对甘薯病毒的检测尚需进一步优化。
Abstract:
120 tube plantlets of sweet potato were used as materials to detect sweet potato virus by single RT-PCR and gene chip. Single RT-PCR results showed that the positive rate of sweet potato curl virus (SPLCV) was the highest up to 62.5%. The detection rates of sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), sweet potato virus G (SPVG) and Sweet potato latent virus (SPLV) decreased successively. The detection rates of SPLCV, SPCSV, SPFMV and SPVG using gene chips were significantly lower than single RT-PCR. Single RT-PCR has strong specificity, good repeatability and good stability. However, single RT-PCR is more suitable for detecting sweet potato virus, gene chip has the characters of fast, convenient and high throughput, but its applica-tion in sweet potato is not mature yet and the detection of SPLCV, SPCSV and SPFMV needs further optimization.
1. 引言
甘薯病毒病已成为制约我国甘薯产业发展的主要因素之一，自2014年开始，甘薯卷叶病毒和甘薯SPVD病毒病复合体在生产上大爆发，发病严重田块产量损失达60%~80% [1]。目前，生产上没有抗病毒的甘薯品种及有效的防控药剂，甘薯茎尖脱毒是解决甘薯病毒病最有效的途径。病毒检测是甘薯茎尖脱毒及健康种薯繁育过程中重要的环节。目前，甘薯病毒常用检测方法主要有血清学检测(ELISA)、指示植物嫁接法、诊断学检测、单一RT-PCR以及基因芯片等 [2] [3]。指示植物嫁接法、诊断学检测主要在甘薯病毒初步鉴定中使用 [4]，单一RT-PCR和基因芯片是甘薯病毒应用较多的检测方法。与血清学检测相比，单一RT-PCR根据甘薯病毒的外壳蛋白或运动蛋白序列设计引物，进行病毒检测，具有灵敏、高效快速等优点 [5]。基因芯片技术则是将分子生物学、信息科学与计算机等技术于一体形成的核酸固相杂交技术，具有高通量、灵敏度高及微型化的优点 [6]。本研究将基因芯片与单一RT-PCR甘薯病毒检测技术进行比较研究，以期为甘薯种苗繁育企业、科研单位对甘薯病毒检测方法提供参考依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
龙薯9号、烟薯25、普薯32、济薯25、哈密、商薯19、红瑶、以名门金石等甘薯品种的试管苗，取其带有叶柄的叶片，液氮处理后，−80℃保存备用。
2.2. 酶和试剂
甘薯病毒检测基因芯片试剂盒组GeneTop SPV Kit购自台湾巨合生物有限公司。DNA、RNA提取试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司。
2.3. 基因芯片检测
利用甘薯病毒基因芯片试剂盒进行甘薯SPFMV、SPCSV、SPVG、SPLV、SPLCV病毒检测。核酸的提取按照其试剂盒说明书进行。RT-PCR反应体系：SPV Mix 9.6 μl、Taq酶0.3 μl、RT反转录酶0.1 μl、样品2 μl。PCR反应条件：45℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃，7 min。将RT-PCR产物根据试剂盒说明书进行杂合反应。将芯片结果与对照表对比，判断感染甘薯病毒种类。
2.4. 单一RT-PCR
SPFMV、SPCSV、SPVG、SPLV、SPLCV等5种病毒的特异性引物参照乔奇等(2012) [2]。根据Sparkzol reagent RNA提取试剂盒以及Spark classic植物基因组DNA提取试验盒的操作步骤进行RNA和DNA的提取。利用SparkscriptII RT Plus Kit试剂盒进行第一链cDNA的合成。以第一链cDNA为模板，分别利用5种病毒的特异性引物进行PCR扩增。反应体系如下：cDNA1μL、10×PCRmix (含MgCl2) 2 μL、正向引物和反向引物各1 μL、ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，补充ddH2O至总体积20 μL。反应条件：98℃变性10 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，36个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据电泳结果判断感染甘薯病毒种类。
3. 结果与分析
3.1. 5种病毒的单一RT-PCR检测结果
单一RT-PCR检测结果表明，在120份供试材料中，检测出带病毒的株系77份，占64.1%。其中SPLCV的阳性检出率最高，达到62.5% (见表1)；其次是SPCSV的阳性检出率为6.67% (表1)、SPFMV的阳性检出率为5.0% (表1)、SPVG的阳性检出率3.33% (表1)，和SPLV病毒的阳性检出率为0%。
Table 1. Detection of viruses infecting sweet potato using single RT-PCR
表1. 单一RT-PCR病毒检测结果
*代表病毒阳性株系数。
3.2. 基因芯片检测结果
利用基因芯片方法对同样的120份供试材料进行病毒检测。结果发现，在所有材料中，2份材料含有SPFMV (见表2)，2份材料含有SPVG病毒(表2)，其余材料均未发现5种病毒(表2)。
Table 2. Detection of viruses infecting sweet potato using gene chip
表2. 基因芯片病毒检测结果
*代表病毒阳性株系数。
3.3. 两种检测方法结果比较
从上面的检测结果可以看出，利用两种检测方法中SPCSV、SPFMV、SPVG、SPLCV等4种病毒的检测结果差异显著，其中单一RT-PCR方法的SPLCV阳性检出率达到62.5%。但是，基因芯片的SPLCV阳性检出率为0。由此可以看出，单一RT-PCR在病毒检测中相对较稳定，而使用试剂盒的基因芯片属于多重RT-PCR，敏感度较低。
4. 讨论
目前，应用于甘薯小量样品的病毒检测技术主要有RT-PCR和基因芯片技术。本研究对120份甘薯试管苗同时利用单一RT-PCR、基因芯片技术进行病毒检测，并将结果进行比较分析，结果发现两种检测方法在SPCSV、SPFMV、SPVG、SPLCV等4种病毒的检测结果差异较显著。我们采用的RT-PCR属于单一RT-PCR，相对与多重RT-PCR，单一RT-PCR具有特异性强、重复性好、稳定性好的优点，但是对于多种病毒的检测，单一RT-PCR相对费时、费工。基因芯片技术在马铃薯、苹果、草莓、百合等植物病毒检测中应用较多 [7] [8] [9]，具有快速便捷、高通量的优点 [10]。基因芯片在甘薯病毒检测中应用较少。基因芯片的类型较多，芯片的杂交条件因研究对象、试验材料的不同而不同。目前，本研究所采用试剂盒的基因芯片是根据甘薯5种病毒的外壳蛋白或复制酶序列设计了5条引物和探针，利用多重RT-PCR，再将PCR产物经过杂合反应形成杂交信号。在本研究中，基因芯片在SPCSV、SPFMV、SPVG等RNA病毒及DNA病毒SPLCV等4种病毒的检测结果显著低于单一RT-PCR技术。这说明用于基因芯片的甘薯病毒检测试剂盒还需进一步优化。
5. 结论
对于小样的甘薯试管苗样品，建议根据实际需要，选择单一RT-PCR或基因芯片进行多次检测或2种方法交叉应用，以期提高病毒株检出率，服务甘薯生产。
基金项目
国家甘薯产业技术体系(CARS-10-B06)、泰山产业领军人才工程(LJNY202113)山东省良种工程(2020LZGC004)及山东省农业科学院农业创新工程项目(CXG2022A14)资助。