趋化因子和共刺激分子在儿童肺炎支原体肺炎发病机制中的研究进展

Research Progress of Chemokine and Costimulatory Molecules in the Pathogenesis of Mycoplasma pneumoniae Pneumonia in Children

摘要: 近年来由于肺炎支原体肺炎在临床上发病率持续升高，且具有病情变化多、进展快、严重者可导致多个系统损害等特点，是临床诊治中需要面对的难题，因此对于早期识别及评估MPP严重程度尤为重要。越来越多的研究证明趋化因子、共刺激分子等炎症性因子在肺炎支原体肺炎中发挥重要作用。趋化因子参与多种急慢性肺部炎性疾病；共刺激分子参与机体免疫反应，进而造成自身免疫性损伤。本文将趋化因子和共刺激分子在儿童肺炎支原体肺炎发病机制中的研究进展作如下综述。

Abstract: In recent years, as the clinical incidence rate of Mycoplasma pneumoniae pneumonia continues to rise, and it has the characteristics of many changes, rapid progress, and serious cases can lead to multiple system damage, which is a difficult problem in clinical diagnosis and treatment, so it is particularly important to identify and evaluate the severity of MPP in the early stage. More and more studies have proved that inflammatory factors such as chemokines and costimulatory mole-cules play an important role in Mycoplasma pneumoniae pneumonia. Chemokines are involved in many acute and chronic pulmonary inflammatory diseases. Costimulatory molecules participate in the body’s immune response, and then cause autoimmune injury. This paper reviews the research progress of chemokines and costimulatory molecules in the pathogenesis of Mycoplasma pneu-moniae pneumonia in children as follows.

1. 引言

肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)是一种感染肺炎支原体的肺部炎症性疾病，占社区获得性肺炎的10%~40% [1]。肺炎支原体是介于病毒与细菌之间的一种可以独立存活，且无细胞壁结构的病原体，它主要通过呼吸道传播，最常见的感染靶器官为肺组织，其好发于儿童，常见肌肉酸痛、咽痛、咳嗽、头痛、发热等特征，可随病情不断发展，转变为重症MPP，从而损伤多个器官，严重者可导致死亡。近年来研究表明，MP的23SrRNA基因位点突变是造成难治性肺炎的主要原因，也可能是发展为重症肺炎的原因 [2]。因此，早期识别MPP患儿病情的严重程度，及时给予合理治疗，避免疾病进展尤为关键。目前国内外肺炎支原体致病机制与细胞黏附、毒素侵袭、免疫损伤等相关，目前越来越多的研究聚焦于免疫炎症反应的重要作用。本文针对趋化因子及共刺激分子在MPP的发病机制综述如下：

2. 趋化因子在儿童肺炎支原体肺炎发病机制的研究

趋化因子是一组由细胞分泌的小细胞因子蛋白或信号蛋白，通过受体介导引起炎性细胞的定向趋化和活化，参与急、慢性炎症反应和免疫调节。根据N端两个半胱氨酸排列顺序被分为4个家族，即CC、CXC、C及CX3C (X代表其他任何氨基酸) [3]，趋化因子主要依靠细胞膜上的G蛋白偶联受体发挥作用 [4]，趋化因子通过异三聚体G蛋白与PLC耦联，经IP3/Ca²⁺和DAG/PKC双信号通路进而传递胞内信号改变细胞形态及运动形式。人体呼吸道的第一道免疫屏障就是气道黏膜，它通过黏膜上的纤毛清除异物，以及黏膜分泌物杀菌等防止病原体侵入机体。当病原体突破第一道免疫屏障后，呼吸道上皮通过多种模式识别受体迅速地识别各种相关分子模式，促进释放细胞因子、趋化因子，进而激活和趋化免疫细胞。其中，两个主要家族CC家族 [5] 和CXC家族的趋化因子在炎症产生及炎症的级联效应中发挥巨大作用。

2.1. 趋化因子与肺炎支原体肺炎

肺炎支原体的致病机制十分复杂，与MP的直接损害作用和MP促进某些细胞因子与炎症介质的释放相关。细胞因子水平紊乱，导致机体免疫调节功能失衡，进而造成机体免疫损害。MP感染以及其他炎症性肺部疾病发生时机体存在免疫应答及细胞因子合成释放的改变，在免疫级联反应中，肺泡巨噬细胞产生的细胞因子发挥了关键作用 [6] [7]。巨噬细胞具有显著的可塑性，其表型可受不同的微环境刺激而改变，表现出明显的功能差异，这个过程被称为巨噬细胞极化 [8]。巨噬细胞包含一连串功能不同的连续状态，其中经典活化的巨噬细胞(M1型)和替代性活化的巨噬细胞(M2型)是局部微环境定向极化巨噬细胞连续状态的两个极端。M1巨噬细胞由Th1分泌的细胞因子如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干扰素γ (interferon-γ, IFN-γ)或细菌成分如脂多糖(LPS)诱导激活，分泌多种白介素、I型IFN以及趋化因子，如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL15、CCL11、CCL19和CCL20；CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13和CXCL16 [9]。M1巨噬细胞具有促炎、杀菌和吞噬功能，活化的M1巨噬细胞在抵抗病原体和组织损伤方面起着重要作用。因而M1巨噬细胞又被称为促炎巨噬细胞。与M1不同，M2泛指在组织修复和抗炎过程中发挥作用的巨噬细胞，又被称为抗炎巨噬细胞。M2巨噬细胞被真菌细胞、寄生虫、免疫复合物和细胞因子如IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β激活，使得M2具有比M1更多的免疫抑制表型，每种M2巨噬细胞都会诱导不同的趋化因子，如CCL1、CCL13、CCL14、CCL17、CCL18、CCL22、CCL23、CCL24和CCL26 [9]。活化的M1细胞参与炎症初始阶段，M2细胞参与慢性炎症的消退 [10]。这种M1/M2极化状态之间的平衡对于炎症的损伤和修复的过程是必要的。

2.1.1. CCL2

单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1，又名CCL2)是第一个纯化的、特征最明显的人类CC趋化因子，因其单核细胞趋化特性而被确认 [11]，主要由单核/巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、人和鼠的肿瘤细胞等分泌。另外气道上皮细胞尤以在病变状态下也可分泌。病毒或细菌等病原体入侵呼吸道，以致支气管上皮细胞分泌的CCL2明显增加。CCL2可以与多种受体结合，但主要通过附着在CCR2的细胞外区域来发挥其生物学效应 [12]，接着诱导PLC的活化，将细胞信号传至核内的转录因子-κB (NF-κB)，并增加该转录因子的浓度。相关研究发现CCL2基因启动子存在NF-κB的结合位点，NF-κB此位点结合促进CCL2基因转录表达，因此NF-κB还能反馈性调节CCL2的表达。NF-κB的浓度升高后增强基因转录并激活、趋化单核/巨噬细胞到炎症反应部位，单核/巨噬细胞通过增加表面黏附分子表达，并分泌大量的IL-1、IL-6，进而参与炎症反应。同时CCL2是Th0细胞向Th2表型极化的调节，以及刺激嗜碱性粒细胞脱颗粒并释放组胺和白三烯参与相关炎性反应。崔莹莹等 [13] 针对CCL2与儿童MPP的关系研究，选取对照组35例、MPP轻症组54例、MPP重症组18例，检测血清中CCL2水平，三组结果以 $\bar{x}\pm s$ 表示分别为(10.02 ± 0.58) pg/ml、(20.47 ± 5.14) pg/ml、(43.72 ± 6.51) pg/ml。三组随着病情程度增加，CCL2呈现逐渐增加趋势，且轻症组与对照组、重症组与对照组以及重症组与轻症组比较差异均有统计学意义，说明CCL2参与了MPP的发生发展过程，而且CCL2的表达与病情严重程度正相关提示CCL2可能作为预测MPP疾病进展以及病情严重程度的指标。

2.1.2. CCL4、CCL8

巨噬细胞炎性蛋白1β (MIP-1β，又名CCL4)，单核细胞是其主要来源，可大量释放于被IL-5激活的嗜酸性粒细胞中。CCL4只有一种特定的受体CCR5 [14]，在小鼠中CCL4通过与其配体结合表现出对嗜酸性粒细胞的趋化活性 [15]，因此CCL4直接参与嗜酸细胞的招募。总的来说，在炎症部位激活的嗜酸性粒细胞通过自分泌的CCL4信号招募更多的嗜酸性粒细胞。据报道，IL-17是另一种潜在的嗜酸性粒细胞激活剂 [16]，也能诱导CCL4的释放 [17]。

单核细胞趋化因子2 (monocyte chemoattractant protein-2，MCP-2，又名CCL8)又称HC14、SCYA8或SCYA10。人类CCL8主要来源为巨噬细胞，还可来源于成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞。目前研究发现，CCL8可与五个趋化因子受体结合发挥作用，分别为CCR1、CCR2、CCR3、CCR5和CCR8，均通过与G-蛋白耦联受体结合介导对靶细胞的特异性效应，其中CCR5主要表达于单核/巨噬细胞、DC细胞、T细胞、初始B细胞及自然杀伤细胞膜的表面。微生物感染后诱导巨噬细胞分泌CCL8招募CCR5+CD4+T参与免疫反应 [18]。CCL8招募和活化多种不同类型的免疫细胞，包括与炎症免疫反应有关的单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞，还可招募γδT细胞，以及与变态反应有关的肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。γδT细胞通过产生IL-17A、IL-17F趋化中性粒细胞迁移和增强其吞噬作用，还能放大Th17效应参与炎症反应 [19]。

CCL4和CCL8有相同受体CCR5，在一项小鼠肺支原体感染过程中细胞因子和趋化因子转录水平变化的研究中，研究者通过应用RT-PCR (Real-time PCR)证实了支原体感染的小鼠肺部CCL4和CCL8的mRNA水平增加；在受感染的小鼠的肺泡灌洗液中发现表达CCL4/CCL8受体CCR5的CD4+ Th细胞增加 [20]。因此，感染肺炎支原体后CCR5在肺中大量的Th细胞中过度表达，同时利用CCR5作为受体介导趋化活性的趋化因子数量相应增加。这表明趋化因子可能有助于Th细胞的招募并停留于受感染的肺部，进而参与疾病进展。

2.1.3. CXCL8

白细胞介素-8 (IL-8，又名CXCL8)主要由肺巨噬细胞产生，由中性粒细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、气道上皮细胞释放。多条信号通路与CXCL8相关，如NF-κB、ERK、MAPK。招募和活化中性粒细胞是CXCL8主要生物学效应，使中性粒细胞脱颗粒释放髓过氧化物酶、溶菌酶、碱性磷酸酶等，因此很多肺部炎症及免疫损伤与CXCL8相关。崔莹莹等 [13] 发现MPP患儿血清CXCL8水平的显著提升很可能导致急性时相蛋白如C反应蛋白、α1-酸性糖蛋白的生成增加，进而加重疾病病情。因此推测CXCL8可评估MPP的病情和预后。

2.1.4. CXCL10

干扰素诱导蛋白10 (IP-10，又名CXCL10)主要来源于单核/巨噬细胞、T细胞和血管内皮细胞，是一种IFN-γ诱导的趋化因子。CXCL-10主要在细胞趋化、抑制新生血管形成 [21]、调控细胞生长、增殖与凋亡等方面发挥作用。Chien等 [22] 发现，通过β2肾上腺素能受体激活cAMP和JNK通路抑制了气道上皮CXCL10的表达。CXCL10与表达于Th1细胞上的趋化因子(C-X-C基序)受体-3 (CXCR3)结合，因此，CXCL10最常与Th1介导的炎性疾病相关，CXCL10对于淋巴细胞、中性粒细胞和NK细胞 [23] 的招募和激活具有重要作用，它的表达可能与抗感染和促进感染都相关 [24]，参与炎症调节、嗜中性粒细胞聚集及获得性免疫应答。CXCL10作为一种促炎症性趋化因子，被发现与多种炎症性疾病如免疫功能障碍、感染性疾病和肿瘤发展密切相关 [25]，有研究指出重症MPP患儿血清CXCL10水平升高的机制可能与该病发生的交叉免疫有关 [26]。既往研究也表明，CXCL10对成人、婴儿和新生儿的脓毒症具有预测能力 [27] [28] [29]。此外，最新的研究发现CXCL10与COVID-19的严重程度和进展相关 [30] [31] [32]。近年来，人们越来越强调炎症性趋化因子和感染性疾病之间的重要联系，血清CXCL10/IP-10很可能是预测儿童重症肺炎支原体肺炎的潜在生物标志物。

3. 共刺激分子在儿童肺炎支原体肺炎发病机制的研究

3.1. 共刺激分子与肺炎支原体肺炎

肺炎支原体发病机制较为复杂，大量的研究发现T细胞介导的细胞免疫占主要原因。T淋巴细胞的完全活化需要T细胞受体(TCR)对抗原肽识别抗原刺激信号和抗原提呈细胞(APCs)共信号分子的双重激活，还需有细胞因子的作用。其中，最具特征性的共信号分子是B7家族的共信号分子。2001年，Chapoval等 [33] 在人类dc衍生的cDNA文库中检测并通过独立逆转录–聚合酶链反应，发现并命名了B7共刺激分子家族成员。B7家族成员在抗原特异性、促进或抑制T细胞参与的免疫反应中发挥着核心作用。B7家族成员主要包括B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1 (B7-H1)、PD-L2 (B7-DC)、B7-H2 (ICOSL)、B7-H3和B7-H4等 [34]。

3.1.1. B7-H1

B7-H1又称程序性死亡配体1 (PD-L1)或CD274。1999年Dong [35] 等人在人类胎盘cDNA文库中最早发现。人B7-H1基因位于人第9号染色体p24区，该基因可表达B7-H1mRNA和B7-H1蛋白，在许多细胞或组织中，B7-H1mRNA表达较B7-H1蛋白的表达更常见，说明mRNA转录成蛋白的过程中发生调节反应 [36]，该基因的启动子序列中可能包含IFN-γ的反应元件，可被IFN-γ诱导而快速表达 [37]。B7-H1也有两种存在形式：膜型B7-H1 (mB7-H1)和可溶性B7-H1 (sB7-H1)，在金属蛋白酶剪切作用下，支气管上皮细胞、单核–巨噬细胞和T细胞的mB7-H1脱落形成人外周血中sB7-H1。已有研究证实sB7-H1可作为共刺激/共抑制信号参与T淋巴细胞的活化、增殖和凋亡，同时可刺激某些炎症因子的分泌以及抑制巨噬细胞吞噬病原体的能力 [38] [39]。B7-H1广泛表达于多种细胞，包括活化的淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和血管内皮细胞等 [38]。B7-H1会根据T细胞表面不同的受体结合发挥不同作用，因此B7-H1具有双向调节作用，当B7-H1与其受体PD-1 (CD279)结合通过胞内段的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)传递抑制信号，从而抑制免疫应答 [40]，另外PD-1还可能通过磷酸化PD-1细胞质尾部的远端酪氨酸和SHP-2磷酸酶来传递信号，可以抑制T细胞生长 [41]，调控免疫反应，在感染性疾病中起到重要作用 [42]；B7-H1还可与主要表达于多种抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC)表面B7-1受体结合，传递抑制信号，也引起免疫抑制反应。此外，B7-H1也可能作为受体，介导T淋巴细胞的分化 [43]。B7-H1也可通过Ｔ细胞表面未知受体B7-H1R传递协同刺激信号,促进Ｔ细胞增殖、活化。

在MPP中，sB7-H1这一共刺激/共抑制分子不仅作为T细胞完全活化的重要信号分子，同时sB7-H1还可通过刺激IL-10、IL-17、TGF-β、IFN-γ、GM-CSF等细胞因子的分泌和细胞因子反向调控sB7-H1的表达，以及其他免疫调节通路影响Th1、Th2、Treg、Th17的分泌和功能，使Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡，由此发生免疫失衡。另外在MPP中还存在体液免疫功能紊乱，IgA、IgG、IgM水平增高或减低，作用于其他器官及系统引起相应的肺外并发症。sB7-H1可能通过某些信号转导通路抑制B淋巴细胞的增殖、活化 [44]，从而导致体液免疫功能紊乱从而在MPP相关的体液免疫反应中发挥了一定作用。因此推测sB7-H1可能与MPP的病情严重程度、肺内外并发症、预后等密切相关。

3.1.2. B7-DC

B7-DC又称为PD-L2。B7-DC在T细胞上无表达，但在由粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子、白介素4、干扰素γ激活的巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞以及脾和淋巴结表达，而非淋巴组织中B7-DC仅在胎盘和心脏上表达 [34] [45]。IL-4和IL-13可诱导B7-DC的表达。B7-DC与B7-H1在结构上有34%同源性，它们拥有共同的受体PD-1。PD-DC与PD-l结合后，通过PD-1免疫受体酪氨酸抑制基序减弱PI3K/Akt激酶活性，限制转录T细胞的增殖基因，并促进T细胞凋亡 [46]；同时还招募蛋白酪氨酸磷酸酶-1，使与其结合的信号分子去磷酸化，从而抑制T细胞的增殖和激活，起到负调控作用。亦有报道PD-L2可能通过PD-1以外的受体使T细胞活化早期的CD40L表达增加促进CD4+ T细胞增殖和细胞因子分泌。Deng等 [47] 发现B7-DC在肿瘤发病机制中的肿瘤的免疫逃逸是通过ERK1/2或JNK途径抵抗淋巴细胞的杀伤作用。Su-Yi Tseng [48] 等人在小鼠实验中发现B7-DC对刺激T细胞产生IFN-γ的能力显著高于B7-1，故B7-DC可能参与Th1为主的免疫反应。目前未发现B7-DC与MPP有关的研究，但是考虑B7-DC可能参与Th1引起的免疫反应，因此推测B7-DC可能在MPP发病机制中发挥作用。

3.1.3. B7-H3

B7-H3又名CD276，为B7家族的一员。Qing-ling Li等研究发现共刺激分子B7-H3可以通过促进Th17的极化，在机体感染肺炎支原体肺炎发病过程中参与调节机体免疫炎症反应 [49]。随着对B7-H3的研究，发现可溶型B7-H3 (sB7-H3)是由树突状细胞、单核细胞、活化的T细胞和B7-H3+的肿瘤细胞表面的膜型B7-H3 (mB7-H3)经金属蛋白酶剪切而来 [50]。sB7-H3既作为T细胞共刺激因子，也作为共抑制因子。sB7-H3对T细胞的正性调节作用主要是促进T细胞的增殖分化，增强了细胞毒性T细胞的细胞毒作用，激活补体和释放趋化因子，并促进分泌IFN-γ等致炎因子的释放，增强免疫反应。负性调节作用主要为抑制Thl和Th2细胞的增殖分化，同时减少IFN-γ、IL-4等细胞因子的分泌，从而抑制免疫反应。当机体被肺炎支原体感染后，sB7-H3主要发挥了对T细胞的共刺激作用，通过各种细胞因子的活化，以及免疫反应的发生，由于免疫复合物在肺泡上皮组织的沉积，从而导致肺泡上皮细胞的变性和自身免疫损伤 [51]，进而加快MPP的病情进展，造成肺炎支原体肺炎感染后的病理变化。另外在生理机制方面的研究表明sB7-H3能够促进肺泡血管内皮细胞的凋亡，进而影响到肺泡通气血流比值。sB7-H3与脓毒血症病例感染的严重程度相关 [52]，因而还可能参与中性粒细胞的活化，而肺炎支原体肺炎的发病机制中中性粒细胞肺损伤至关重要。Gang Li等人发现 [53] TNF-α在难治性肺炎支原体肺炎患者的支气管肺泡灌洗液中高表达。有研究发现sB7-H3高水平与TNF-α的表达水平显著相关。肺泡中TNF-α的高表达，不但可导致肺泡原位损伤，还会进入血液循环，造成肺外组织损伤。sB7-H3参与肺炎支原体肺炎的发生发展过程，因此不难推测sB7-H3可能与患儿病情程度相关，姜之焕等 [54] 研究指出重症MPP急性期sB7-H3水平高于轻症MPP急性期，可以表明sB7-H3与MPP病情的轻重有关，该指标可能为病情评估及早期预测病情提供新的依据。

3.1.4. B7-H4

B7-H4又称B7sl和B7x，是2003年由多位科学家发现的B7家族的一个成员，在T细胞的免疫应答中提供了重要的负性信号。人B7-H4基因位于人第1号染色体p11.1区基因片段(1p11.1) [55]。人B7-H4mRNA普遍表达于包括胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏等多种组织中。与B7-H4mRNA的组成性高水平表达相反，B7-H4蛋白却在这些正常组织中检测不到，说明B7-H4在外周组织中的翻译受到严格控制。B7-H4还参与肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病的发展。动物实验显示 [56] [57]，B7-H4可调节免疫反应，抑制TH1与TH2细胞的产生，进而导致免疫紊乱，因此推测B7-H4可能参与肺炎支原体肺炎的致病过程。目前尚无人感染肺炎支原体肺炎与B7-H4表达的相关研究，仅有郭杰 [58] 初步证明了猪肺炎支原体感染下肺脏组织中B7-H4阳性细胞数增加，后续还需相关临床研究进一步探索。

4. 小结

综上所述，通过肺炎支原体肺炎发病机制中存在的免疫紊乱的研究，我们可以认为趋化因子和共刺激分子在MPP中发挥重要作用。许多学者研究表明部分趋化因子及共刺激分子参与了肺炎支原体肺炎的发病和发展，这为预测MPP的疾病进展和病情严重程度提供了新思路，为早期合理治疗，预防和改善患儿预后提供新的检测指标。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]