摘要:
建立了一种实时荧光定量PCR法检测驴乳中牛源性、羊源性的检测方法。将牛乳、羊乳分别以0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0% (v/v)的比例添加进驴乳中，制成牛乳和驴乳、羊乳和驴乳的混合乳样品。提取DNA后用实时荧光定量PCR仪检测。结果表明：驴乳中掺杂牛乳、羊乳后可鉴别出，检出限分别为0.3%、0.1%。该方法通量大、灵敏度高、特异性好，实现了对驴乳中牛、羊源性成分快速、准确的检测，对保障相关产品市场安全具有重要意义。
Abstract:
A real-time fluorescence quantitative PCR method
was established for the determination of bovine and sheep origin in donkey
milk. The mixed milk samples of cow milk and donkey milk, goat milk and donkey
milk were prepared by adding cow milk and goat milk into donkey milk at the
proportions of 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% and
1.0% (V/V), respectively. DNA was extracted and detected by real-time fluorescence
quantitative PCR. The results showed that donkey milk adulterated with cow’s
milk and goat’s milk could be identified and the detection limits were 0.3% and
0.1%, respectively. This method has high throughput, high sensitivity and good specificity,
realizing the rapid and accurate determination of bovine and sheep derived components
in donkey milk. It had great significance for ensuring the security of related products.
1. 引言
随着生活水平不断的提高，人们对乳及乳制品的需求量不断增加，并且对乳及乳制品的需求也逐渐由数量向质量转变，更倾向于追求一些高价值的乳制品。驴乳氨基酸种类齐全，数量充足，比例合理；矿物质和维生素含量丰富，钙磷比1.7：1，硒含量是牛乳的5.16倍，维生素Ｃ含量是牛乳的4.75倍；乳清蛋白含量比牛乳高50%。在各种家畜乳中，驴乳的成分和人乳最为接近 [1] [2]。由于驴乳产量很少，并且其产量又受到品种、营养状况、环境、饮水、繁殖、健康状况、泌乳阶段、挤乳频率、挤乳方式及是否有幼驴等因素的影响，因此驴乳的价格要远高于牛乳和羊乳。基于此所带来巨大商业前景，一些不法商贩、企业为了获取更多的利益，在驴乳中加入其它物质如牛乳、羊乳、水、豆浆增加乳液体积减少成本。这些掺杂使假行为不但损害了消费者的合法权益，有时还会引起严重的健康问题，例如，牛乳的α-S1酪蛋白和β乳球蛋白被指控具有过敏性问题。
对于乳品掺假的鉴定技术，目前除了传统的感官、化学检测 [3] 方法以外，最新开展的近红外光谱技术 [4] [5]、电子鼻技术 [6] [7]、酶联免疫技术 [8]、电泳 [9] [10]、核磁共振 [11]、高效液相–串联质谱技术 [12] [13] 以及实时荧光PCR检测技术等得到越来越多的研究。市场上诸多的乳制品经过了高温高压的处理，这些加工处理可能改变了其结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定部位。加之乳品间大部分的主要成分相似，因此这些方法要对市场中加工乳制品做出准确性高的检测还是比较困难。基于上述原因，以核酸为基础的实时荧光PCR检测方法凸显了其优势 [14]。一些学者运用PCR技术已经成功检测出了羊乳中极为少量的牛乳成分 [15] [16] [17]。
试验拟向驴乳中模拟掺杂不同体积含量的牛乳、羊乳，提取DNA，采用实时荧光定量PCR法同时对驴乳中掺杂的牛乳、羊乳进行鉴别，建立一种实时荧光定量PCR法快速检测驴乳中的牛乳、羊乳成分的检测方法。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
材料：驴乳，东阿阿胶股份有限公司提供；牛乳，市售；羊乳，市售。
主要试剂：Dneasy mericon食物核酸提取试剂盒，凯杰企业管理(上海)有限公司；牛、羊基因组DNA检测试剂盒，宝日医生物技术(北京)有限公司。
2.2. 主要仪器
7500 Fast Real Time System PCR，Applied Biosystems公司；微量移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL)，德国Eppendorf公司。
2.3. 方法
2.3.1. 样本制备
驴乳、牛乳、羊乳分别颠倒混匀，将牛乳、羊乳分别以0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0% (v/v)的比例添加进驴乳中，制成牛乳和驴乳、羊乳和驴乳的混合乳样品。
2.3.2. 样品中DNA的提取
取2 mL样品于50 mL离心管中，加入10 mL食品溶解缓冲液和25 μL蛋白酶K溶解，混匀，在60℃下恒温培养30 min，在冰上冷却至室温，12,000 r/min离心5 min。取700 μL清液至含有500 μL氯仿的2 mL微量离心管中，混匀，12,000 r/min离心15 min。取350 μL上层水相至含有350 μL缓冲液PB的2 mL微量离心管中，涡旋混匀。转移到置于2 mL收集管中的快速旋转柱中，12,000 r/min离心1 min，丢弃流经的液体。将500 μL缓冲液AW2加入快速旋转柱中，12,000 r/min离心1 min，并丢弃流经的液体。重复使用收集管，并在12,000 r/min下再次离心1 min以干燥膜。将QIAquick旋转柱转移至2 mL离心管，并用移液枪将150 μL缓冲液EB直接移到QIAquick膜上，室温下孵育1 min，12,000 r/min离心1 min以洗脱。每个样品分别做3组平行。
2.3.3. 探针标记
探针标记见表1。
Table 1. Multiplex real-time quantitative PCR probe labeling
表1. 多重实时荧光定量PCR探针标记
2.3.4. PCR反应体系配置
多重实时荧光定量PCR反应体系配置见表2。
Table 2. Multiplex real-time quantitative PCR reaction system (Total volume 25 μL)
表2. 多重实时荧光定量PCR反应体系(总体积25 μL)
*1Negative Control反应时，用dH2O替代样品DNA；Positive Control反应时，用Control DNA for Ovine and Bovine替代样品DNA。
2.3.5. PCR 反应条件
预变性：95℃，10秒，循环1次；变性：95℃，5秒，循环40次；退火：60℃，30秒，循环40次。
2.3.6. 结果判定
Negative Control 实验FAM、ROX荧光信号未检出，HEX荧光信号检出且Positive Control实验FAM、ROX、HEX荧光信号均检出，结果正常。实际样品中不管HEX荧光信号是否检出，只要有FAM荧光信号检出，且CT值 ≤ 35，则判定为含有牛源性成分；如果CT值 > 35，则视为不含有牛源性成分。只要有ROX荧光信号检出，且CT值 ≤ 35，则判定为含有羊源性成分；如果CT值 > 35，则视为不含有羊源性成分。
3. 结果与分析
3.1. 驴乳中掺杂牛乳的实时荧光PCR检测结果
表3中牛源性成分模拟混合样品的实时荧光PCR结果显示，随着牛乳含量占比的升高，其CT值逐渐降低，CT值介于21.37~38.25之间；当牛乳含量占比(v/v)小于等于0.3%时，CT值 < 35，视为未检出牛源性成分。当牛乳含量占比增加至(v/v) 0.8%时，CT值明显降低。实验结果表明，当牛乳以体积分数大于等于0.3%掺入至驴乳中时，均能通过实时荧光PCR获得阳性检出结果，说明牛源性成分实时荧光PCR体系检测样品的检出限可达到0.3%。
Table 3. Real-time fluorescence PCR results of simulated mixed samples of bovine origin components
表3. 牛源性成分模拟混合样品实时荧光PCR结果
3.2. 驴乳中掺杂羊乳的实时荧光PCR检测结果
表4中羊源性成分模拟混合样品的实时荧光PCR结果显示，随着羊乳含量占比的升高，其CT值逐渐降低，CT值介于21.39~35.60之间；当羊乳含量占比(v/v)小于等于0.1%时，CT值 < 35，视为未检出羊源性成分。实验结果表明，当羊乳以体积分数大于等于0.1%掺入至驴乳中时，均能通过实时荧光PCR获得阳性检出结果，说明羊源性成分实时荧光PCR体系检测样品的检出限可达到0.1%。
Table 4. Real-time fluorescence PCR results of simulated mixed samples of sheep derived components
表4. 羊源性成分模拟混合样品实时荧光PCR结果
4. 结论
本实验采用PCR法对驴乳中掺牛乳、羊乳进行了鉴定，混合乳的CT值随掺杂牛乳、羊乳含量的增加而降低，驴乳中掺杂牛乳、羊乳的实时荧光PCR检出限分别可达0.3%、0.1%。此方法能够快速准确的对驴乳中掺假牛乳、羊乳进行鉴别检测，为乳制品掺假掺杂检测以及食品安全监管提供了强有力的技术支持，也推动了实时荧光定量PCR检测技术在食品特别是乳制品领域中的应用研究。
NOTES
*通讯作者。