ATR抑制剂抗肿瘤研究进展

Research Progress of ATR Inhibitors in Anti-Tumor

摘要: DNA损伤反应(DDR)机制负责检测DNA损伤、暂停细胞周期和启动DNA修复。共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)是DDR核心的关键激酶，负责感应复制应激(RS)并将其发送到S和G2/M检查点以促进修复。目前，靶向ATR药物已成为多个药企的焦点药物管线，并有多个药物已进入临床阶段。本文阐述了ATR与肿瘤之间的关系，总结了支持ATR抑制剂作为单一疗法以及与化疗、放疗和新型靶向药物如PARP抑制剂联合使用的数据，并讨论了当前的临床试验数据以及将ATR抑制剂应用于临床和识别生物标记物的研究进展。

Abstract: The DNA damage response (DDR) machinery is responsible for detecting DNA damage, pausing the cell cycle and initiating DNA repair. Ataxia telangiectasia and Rad3-related protein (ATR) are a key kinase at the heart of the DDR, responsible for sensing replication stress (RS) and signalling it to S and G2/M checkpoints to facilitate repair. At present, targeted ATR drugs have become the focus of drug pipelines for many pharmaceutical companies, and many drugs have entered the clinical stage. This article describes the relationship between ATR and tumors, summarizes the data supporting the use of ATR inhibitors as monotherapy and in combination with chemotherapy, radiotherapy and new targeted drugs such as PARP inhibitors, and discusses current clinical trial data and the use of ATR research progress in the application of inhibitors to the clinic and the identification of biomarkers.

1. 概述

细胞每天都会受到数以万计的DNA损伤的挑战，这种DNA损伤可能是由于暴露于不同类型的辐射或基因毒性物质而引起的外源性损伤，或者是通过内源性损伤引起的，例如，碱排尿和脱氨或细胞代谢的反应性副产物。如果未修复或异常修复，这些病变可能对细胞是致命的甚至引起基因有害突变，这些突变可影响细胞活力或诱导异常细胞行为，从而导致恶性肿瘤(如癌症)的发生 [1]。由于基因改变对细胞以及整个生物体的生存和生存能力具有潜在影响，细胞已经形成了一个复杂的信号通路网络——统称为DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)，DDR负责协调DNA损伤的早期检测，并向细胞周期检查点和DNA修复途径发送信号，暂停细胞周期以启动修复，或在损伤过于严重时启动细胞死亡 [2]。因此，DDR是确保整体基因组稳定性和细胞活力的关键。

目前可以通过两种不同的方式来治疗DDR缺陷所导致的人类癌症。首先，大多数传统的癌症治疗方法，如化疗和放疗，都是通过破坏DNA来起作用的。DDR通路的上调为细胞提供了一种避免较重损伤和抵抗细胞死亡的方法 [3]。因此，如果与化疗和放疗联合使用，DDR抑制剂将阻断这种耐药机制。其次，如果代偿性DDR途径可以被靶向，DDR成分的缺失可能会产生肿瘤特异性。这利用了合成致死(Synthetic Lethality, SL)的概念，即两个基因(或通路)中的一个单独失活不会影响细胞存活，但两个基因的失活都会导致细胞死亡 [3]。在SL关系中，ATR-ATM是最有前途的，因为ATM除了参与细胞周期检查点激活外，还参与DNA修复。聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制剂作为单一疗法治疗乳腺癌BRCA突变癌的成功证明了这一概念的成功应用。这里开发的途径是同源重组修复(homologous recombination re-pair, HRR)途径，其中乳腺癌1号基因(breast cancer 1, BRCA1)和乳腺癌2号基因(breast cancer 2, BRCA2)起关键作用。

ATR与DNA损伤反应没有直接联系，然而，它涉及保护细胞免受复制压力(replication stress, RS)。它通过激活检查点激酶CHK1来防止复制叉崩溃和诱导G2/M期阻滞来实现这一点。癌细胞快速增殖，容易受到大量RS，因此特别依赖ATR信号通路。

1.1. ATR的结构及功能

共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶(Ataxia telangiectasia and Rad3-related, ATR)是磷脂酰肌醇3-激酶样激酶((phosphatidylinositol 3-kinase like kinase, PIKK)家族的成员之一，该家族激酶还包括共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated, ATM)，DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK/PRKDC)，转化/转录相关蛋白(transformation/transcription associated protein, TRRAP)，雷帕霉素的哺乳动物靶点(mammalian target of rapamycin, mTOR)等。

ATR由2644个氨基酸组成，N端为ATR相互作用蛋白(ATR-interacting-protein, ATRIP)结合结构域，是ATR激活的重要结构域。C端为激酶结构域，可磷酸化下游蛋白，具有将靶蛋白如细胞周期检测点激酶1 (cell cycle checkpoint kinase 1, Chk1)、范可尼贫血症相关蛋白(Fanconi anemia protein, FANCI)、Wemer综合征蛋白(Wemer syndrome protein, WRN)、细胞周期检测点激酶1 (cell cycle checkpoint kinase 1, Chk1)等丝氨酸或苏氨酸磷酸化的功能。

对PIKK家族蛋白质中PI3K结构域的序列相似性分析表明，ATR与ATM、mTOR和对生殖器有形态学影响的抑制物1 (suppressor with morphological effect on genitalia 1, SMG-1)之间的相似性有限，并且有人认为ATR、ATM、SMG-1和mTOR可能从一个共同的祖先分化而来 [4]。ATR和ATM的磷酸化底物也有相当大的重叠。ATR和ATM都是参与DNA复制、重组和修复的磷酸化蛋白，以及调节细胞周期对DNA损伤的反应。ATM基因不是必需的，但是种系突变会导致共济失调毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia, A-T)。另一方面，ATR基因是必需的，双等位基因丧失ATR基因功能会导致早期胚胎死亡。没有关于人类完全缺乏ATR功能的记录，但塞克尔综合征是一种由亚型ATR突变引起的疾病，可导致生长迟缓和小头畸形。患有Seckel综合征的小鼠即使与p53突变小鼠杂交也不易患癌症 [4]，这表明ATR抑制不导致癌症。ATR激活后可通过多种调控细胞生物过程，包括细胞周期阻滞、启动复制叉、抑制复制起点以及修复DNA双链断裂。

1.2. ATR分子通路

ATR的分子通路对于维持基因组的稳定性和完整性至关重要，并进一步促使细胞存活。在典型信号通路中，ATR被激活，以响应停滞的复制叉(复制应激)或处理DNA双链(double-stranded DNA, dsDNA)断裂(double strand break, DSB)后的DNA末端切除。这些类型的DNA损伤可在DNA复制过程中内源性发生(在S期进展失控的癌细胞中可能更为常见)，也可通过暴露于辐射或DNA成像化疗药物而外源性发生。ATR激活的共同信号是复制蛋白A (replication protein A, RPA)快速结合的单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)。ATR相互作用蛋白与ATR形成复合物，然后与RPA包裹的单链DNA结合，并将ATR招募到DNA损伤部位。Rad17还与RPA包被的单链DNA结合，进而招募9-1-1复合物(Rad9-Rad1-Hus1)和拓扑异构酶II结合蛋白1 (topoisomerase II binding protein 1, TopBP1)，刺激ATR蛋白激酶的活化。ATR磷酸化并激活CHK1激酶和其他效应蛋白，以诱导细胞周期阻滞和DNA修复，从而防止细胞进入有丝分裂，并使DNA受损或复制不完全。ATR减缓复制起始点的触发和分叉进程，并稳定复制以防止折叠成DNA双链断裂。ATR还可以帮助重新启动暂停的复制分叉。如果DNA损伤负荷足够高，ATR的丢失或抑制会导致基因组不稳定或细胞死亡 [4] [5] (见图1)。

2. ATR与肿瘤之间的关系

由于ATR-Chk1检查点途径可确保细胞在复制应激后的存活，因此正常的检查点被认为是化疗耐药的机制。在癌症中靶向ATR的基本原理源于对ATR活性降低的小鼠模型的研究，ATR缺失或亚型化与p53缺失之间存在SL效应，这显示抑制ATR可能对p53缺陷肿瘤的治疗有效果。

各种观察结果揭示，检查点抑制确实可能选择性地使癌细胞致敏。几十年来，大多数肿瘤细胞都缺乏G1检查点。例如，许多癌症的p53或p53途径的其他成分发生突变，导致依赖S和G2检查点来阻止细胞周期并提供修复和存活，抑制S和G2检查点可能会优先杀死这些p53缺乏肿瘤细胞。咖啡因是一

Figure 1. Activation and role of ATR kinase in DNA damage response and genome stability maintenance [6]

图1. ATR激酶在DNA损伤反应和维持基因组稳定性中的激活和作用 [6]

种PIKK抑制剂，它优先使p53突变细胞对电离辐射敏感。检查点反应的一个或多个其他成分可能在癌细胞中发生突变或受损，由于正常细胞中所有检查点的功能都完好无损，因此，ATR抑制剂对其余检查点的抑制可能对癌细胞产生比对正常细胞更大的有害影响。

在正常细胞中，Chk1通路和几个Chk1非依赖通路在复制分叉停止后都被激活。未转化细胞中的Chk1非依赖性机制包括p38的激活，p38与Chk1协同阻止有丝分裂进入。在未转化细胞中复制分叉停止后，细胞周期蛋白B1启动子活性也发生下调，与Chk1或p38无关。相反，肿瘤细胞完全依赖Chk1通路来获得所需的反应，这可能是因为它们缺乏一条或多条额外的平行通路，在未转化细胞中，这些通路在缺乏Chk1的情况下确保复制检查点反应。因此，抑制Chk1和羟基脲可增强对肿瘤细胞的杀伤作用，但不会增强对未转化细胞的杀伤作用 [7]。所有这些都表明靶向ATR对某些肿瘤尤其有毒，特别是对高RS水平的肿瘤，并促使ATR抑制剂的开发。ATR抑制剂对表达蛋白酶促进癌基因(如细胞周期蛋白E)的细胞具有毒害作用，特别是在p53缺乏的情况下。新兴的生物标记物有望提高对ATR抑制剂单一疗法的敏感性，ATM丢失和p53途径生物标记物已得到最广泛的研究。

2.1. ATM丢失

ATM和ATR的通路显著重叠，癌症中ATM丢失的频率因肿瘤类型而异。ATM缺失已被证明在多种血液肿瘤和实体瘤体内对ATR抑制剂具有敏感性 [7] [8]，包括：ATM缺陷型慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)、胃癌和胰腺癌,这些研究支持路径相互依赖理论，即在因ATM路径功能失调而产生的未解决DSB中，抑制ATR会导致有丝分裂出错和肿瘤细胞死亡增加。尽管确定ATM突变状态的最佳方法(如免疫组织化学与下一代测序技术)仍存在争议，依然有多项临床试验，纳入ATM缺陷肿瘤患者。

2.2. p53突变

活化的ATM对p53的磷酸化是实现G1细胞周期检查点的关键，在DNA复制之前修复DNA损伤 [9]。如前所述，在肿瘤特异性p53失活的情况下，假设癌细胞将更依赖于ATR依赖的细胞内S和G2/M细胞周期检查点，因此也对ATR抑制更敏感。然而，与野生型(WT) p53相比，缺陷型p53细胞中的ATR抑制导致泛核γH2AX染色增加，并且发现使用AZD6738的类似单剂治疗对缺陷型p53 CLL细胞系具有选择性毒性 [10]。在一种莫氏综合征中，p53基因敲除会增加RS水平，并以SL方式加速衰老。p53缺失作为ATR抑制剂介导的化疗敏感性指标，在14个癌细胞系中，5个野生型p53细胞系中有4个对VE-821联合顺铂的反应最弱，其中2个细胞系中的p53基因敲除增强了对联合治疗的敏感性 [11]。p53在使用ATR抑制剂作为放射增敏剂方面的作用结果上相互矛盾，AZD6738作为放射增敏剂独立于p53状态，在另一项研究中，其对p53缺陷细胞系的放射敏感性大于野生型p53细胞 [12]。

在同基因匹配的细胞系或小细胞系组中单独检测一个基因可能不会产生结论性的结果，因为癌细胞通常会有几个分子变化，这些变化可能相互混淆，或者基因需要共存以获得药物敏感性的特异性表型，例如，与G1检查点控制和RS丢失相关的其他缺陷；GS期细胞周期蛋白及其CDK相关的过度表达也可能导致对ATR的敏感性 [11] [12] [13]，而不仅仅是p53状态，此外，如突变Ras和依赖端粒替代性延长的肿瘤等都促使依赖ATR的其他致癌机制在临床上得到了相应数据研究。

高表达致癌基因诱导细胞信号失调，干扰细胞周期；抑制ATR通路可以导致细胞毒性；低氧肿瘤细胞可能会造成RS，导致其对ATR抑制作用更敏感；ATM缺陷，对ATR抑制剂更为敏感，这促使对于ATR在肿瘤领域的研究 [14]，总的来说，这些研究为ATR-Chk1途径抑制剂与DNA损伤化疗的联合使用提供了支持。

3. 在研的ATR抑制剂药物

由于ATR的体积过大、对单链DNA-双链DNA连接束(一种不稳定结构)的依赖、对激活所需的共激活蛋白比如RPA的依赖以及晶体结构的缺乏，导致难以对其建立体外高通量筛选并且阻碍了基于结构的药物设计 [15]，进而使得在全球范围内，ATR的药物开发计划落后于PARP和ATR本身的下游靶点CHK1等DDR蛋白。

天然产物咖啡因和五味子乙素是最先发现的抑制ATR的分子，对ATR的IC₅₀分别为1.1 mM和7.7 Um [16]，对ATR的抑制作用较弱且非特异性。其他的ATR抑制剂在作为其他靶点的抑制剂时，首次开发对于ATR的抑制时才得以被发现。例如，NU6027最初是作为CDK2抑制剂开发的，但后来发现，当它使乳腺癌和卵巢癌细胞系对顺铂敏感时，可抑制ATR (ATRIC₅₀ = 6.7 μM) [17]。最新的进入临床试验的ATR抑制剂的临床候选药物——M1774、M4344等的研发进展如表1所示。

据现有ATR抑制剂的结构特点可以将抑制剂可分为吡嗪类、嘧啶类、吡啶类以及其他类。

3.1. 吡嗪类

Vertex Pharmaceuticals开发了一系列基于吡嗪环结构的高活性且选择性的ATR抑制剂，包括化合物1 (VE-821)，化合物3 (VE-822, M6620, VX-970, Berzosertib)等(如图2)。早期高用量筛选得到了化合物

Table 1. Research progress of ATR inhibitors

表1. ATR抑制剂的研究进展

Figure 2. VE-822 reconstruction process

图2. VE-822的改造过程

1 (ATRIC₅₀ = 26 nM)，并且发现其对相关的PIKK、ATM和DNA-PKcs具有选择性 [18]。Ronald等人 [19] 在早期的工作中，通过用异丙基砜取代甲基砜，ATR抑制效力提高了3倍，得到化合物2。后寻找苯胺部分的最佳替代物，通过将化合物2中苯胺的五元和六元杂芳香取代物对接到ATR同源模型中显示，仲苄胺取代的异恶唑环将很好地占据ATP结合位点，并模拟原始苯胺的形状和平面性质，便得到化合物3，从而进一步提高了ATR亲和力、选择性、水溶性和细胞分析中的活性 [20]。化合物3与ATR的活性位点对接中(图3所示)，氢键与铰链、独特的残基 Gly2385、Asn2480和Asp2494结合，它们是保守的镁结合位点和盐桥的一部分。苯环周围的极性残基显示为棒状，异恶唑的苯环在ATR的P环下方靠近带负电荷的区域深入延伸。化合物3对相关激酶和无关蛋白质(如hErg和P450酶)的选择性保持 > 100倍，并且具有适合静脉给药的PK特性，是2012年第一个进入临床试验的ATR抑制剂。化合物3单药治疗耐受性良好，剂量限制性毒性和药物相关的3~4级不良事件发生率均不超过480 mg/m²，其单药治疗反应与对于ATR抑制剂敏感的潜在的预测性生物标记物一致，临床上前后成对活检证实了其靶向抑制，即通过pCHK1减少至少73%来证实它的靶向性 [21]。

Figure 3. VE-822 docking with ATR active site [13]

图3. VE-822与ATR的活性位点对接 [13]

3.2. 嘧啶类

已经报道的嘧啶类的ATR抑制剂主要是化合物4 (NU6027)，化合物5 (AZ20)，化合物6 (AZD-6738, Ceralasertib)和化合物7 (VX-803, M4344) (如图4)。起初作为细胞周期蛋白依赖性激酶2 (Cyclin-Dependent Kinase2, CDK2)抑制剂的NU2058能使细胞对顺铂的细胞毒性高度敏感，但与CDK2抑制剂无关，而类似的化合物4也具有类似的作用 [22]。这些观察结果，加上已知的ATR敲除对顺铂的敏感性，促进了研究者对于化合物4是否抑制ATR的研究。Peasland等人 [21] 测定了化合物4对细胞ATR和CDK2的抑制作用、对DNA损伤诱导的细胞周期阻滞的调节、对HR的修复以及对不同p53状态的细胞中细胞毒性物质的增强程度，并探讨了当DNA单链断裂受损时化合物4的合成致死性。化合物4是一种低微摩尔数的ATR抑制剂，对ATR的IC₅₀为6.7 umol/L。化合物4在完整细胞中是比CDK2更有效的ATR抑制剂，并且不抑制细胞DNA-PK或ATM，还可减弱G2/M期阻滞，抑制HR功能，与PARP抑制联合使用可导致SL，是一种用于进一步药物开发的新型先导化合物，也是研究ATR的极好工具化合物 [23]。

Figure 4. Pyrimidineinhibitors for ATR

图4. 嘧啶类的ATR抑制剂

后来Foote [24] 等人开发了化合物5，化合物5对ATR具有选择性，IC₅₀为0.05 μmol/L，但化合物5是CYP3A4的时间依赖性抑制剂，水溶性低。CYP3A4的抑制，特别是基于机制的抑制，是临床药物之间相互作用所关注的问题，并且其低溶解度限制了最大可吸收剂量。这些化合物不良特性增加了临床开发失败的风险，因此化合物5不被认为是临床研究的合适候选物。消除CYP3A4的时间依赖性并实现高水溶性，同时保持高ATR效力、优异的选择性以及化合物5所显示的良好药代动力学特性，是下一步优化阶段的关键药物化学设计目标 [25]。为了消除抑制CYP3A4引起的药物之间相互作用使此类药物和许多可能的辅助药物的联合给药复杂化的不良活性，相关的亚砜胺吗啉嘧啶类似物化合物6成功进入临床试验。化合物6的亚砜亚胺的R立体化学最初是从亚砜前体的立体化学中推断出来的，亚砜亚胺的亚胺化构型在AZD6738中得以保留，后来从X射线结构中得到证实 [25]，在6的结构中通过引入亚砜肟从而消除了甲砜的中心对称填充特性。化合物6对ATR具有高度特异性(ATR IC₅₀ = 74 nM)，是一种更加适合于口服生物利用的ATR抑制剂。化合物6抑制ATR对下游Chk1的磷酸化，促使DNA损伤累积的增加，从而促使肿瘤细胞的凋亡，目前已经推进到II期临床试验中，无论是单一疗法还是联合化疗药物，都开展了多项临床试验 [26]。

Vertex最初开发的另一种具有良好口服生物利用度的ATR抑制剂7获得了默克公司的类似许可，是一种有效且高选择性的ATR抑制剂(ATR IC₅₀ = 8 nM)，化合物7通过诱导细胞突变和DNA损伤杀死癌细胞，复制应激和神经内分泌基因表达特征与化合物7治疗反应显著相关，可作为7的预测性生物标记物，目前正在进行I期临床试验单一疗法研究和与卡铂、吉西他滨和顺铂等联合研究，探究不同给药方案的安全性和耐受性 [27]。

3.3. 稠合吡啶类

稠合吡啶类的ATR抑制剂主要包括化合物12 (BAY-973)，化合物13 (BAY-1895344, Elimusertib)，化合物14 (RP-3500)等。工具化合物AZ20 (如图5)在同源模型中揭示了与ATR在ATP结合口袋的两个主要相互作用：一个氢键通过铰链区与吗啉氧形成，另一个额外的氢键通过与吲哚NH结合形成。基于这些建模研究的总体结果，Lücking等人 [28] 将喹啉衍生物9作为一种新的ATR抑制剂进行开发，然其富含电子的吡咯部分可能导致潜在DMPK问题，因此合成了相应的吡唑喹啉类似物10，吡唑喹啉类似物10在体外对ATR的抑制活性非常低(IC₅₀ = 5050 nm)，在此之前，由于10的合成较难，在10的制备完成之前，萘啶类似物11更易合成出来，即在萘啶核的7位添加氮旨在简化支架上所需2，4，8区域化学的合成。化合物11在体外显示出很好的ATR抑制活性(IC₅₀ = 125 nM)，后通过结构修饰进一步提高激酶活性得到化合物12 (IC₅₀ = 59 nM)，但是化合物12对结构相关PIKK-mTOR的低选择性被认为是一个潜在的毒性问题，因此提高对mTOR的选择性是一个继续优化的重要参数。后续开发了化合物13，其8位五元芳香取代基的两个氮原子的存在和位置对于提高ATR抑制活性至关重要，在一次彻底的临床前评估中，化合物13显示了最佳的体外和体内临床前总体特征，并最终被选为临床候选化合物。在体外的生物化学(IC₅₀ = 7 nM)和HT-29细胞的细胞机制(IC₅₀ = 36 nM)中证明了其对ATR的有效的抑制作用。化合物13对mTOR表现出良好的选择性(IC₅₀值之比mTOR/ATR = 61)，在体外也表现出对各种癌细胞系的非常有效的抗增殖活性，例如CRC细胞系HT-29 (IC₅₀ = 160 nM)和LoVo (IC₅₀ = 71 nM)以及B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-8 (IC₅₀ = 9 nM)。

Figure 5. BAY-937 reconstruction process

图5. BAY-937的改造过程

化合物13 (如图6)是一种口服ATR抑制剂，已进入II期临床试验，可能为单一疗法中某些DDR缺陷的癌症的治疗提供新的治疗选择，并与DNA损伤–诱导或DNA修复通过提高疗效而损害癌症治疗相结合。1 mmol/L的化合物13仅对456种激酶中的6种表现出活性，是一种选择性的低纳摩尔ATR激酶活性抑制剂，它能有效抑制具有DDR缺陷(包括ATM畸变)的不同来源的广谱人类肿瘤细胞系的增殖 [29]。与ATR抑制剂AZD6738和M6620相比，化合物13显示出优越性，它的高效性和选择性使其作为单一疗法在具有DDR缺陷的多种肿瘤类型中具有更强的抗肿瘤活性。化合物13的血浆暴露明显高于肿瘤细胞的抗增殖浓度水平。相比之下，AZD6738和M6620的血浆暴露没有超过肿瘤细胞中抗增殖活性所需的浓度，这与它们在单一疗法中的弱活体抗肿瘤疗效相呼应 [30]。化合物13在不同肿瘤组织学的DDR缺陷的癌症中表现出强大的单一治疗功效，并且与DNA损伤–诱导或DNA修复–折衷疗法相结合具有协同活性。化合物13目前正在被应用于晚期实体瘤和淋巴瘤患者进行临床研究，在多种具有不同肿瘤适应症的异种移植模型中具有强大的活体抗肿瘤功效，携带DNA修复缺陷，从而验证了肿瘤固有DNA修复缺陷和ATR阻断的SL概念，但仍然需要进行进一步的临床研究，以了解哪些DDR缺陷对ATR抑制敏感性的影响最大。

Figure 6. Fused pyridine ATR inhibitors

图6. 稠合吡啶类的ATR抑制剂

化合物14对ATR的IC₅₀为0.9 nM，其I/II期研究于2020年7月开始，预计将于2022年7月完成，正在评估安全性在癌症患者中单独或与talazoparib联合给药的耐受性、药效学、抗肿瘤活性和最大耐受剂量 [31]。

3.4. 其他类

以前研究发现咖啡因(15, caffeine)、五味子乙素(16, Schisandrin B)、渥曼青霉素(17, Wortmannin)等(如图7)也能抑制ATR。Caffeine虽然可以通过干扰DNA损伤诱导的细胞周期阻滞和破坏DNA损伤应答机制从而促进肿瘤细胞死亡，但它同时也会抑制ATM，因此对ATR选择性较差，并且高浓度的剂量也会对正常细胞和组织产生毒性作用 [32]。早期也研究发现五味子中化学成分Schisandrin B对ATR具有抑制作用，其IC₅₀为7.3 μmol/L，但选择性较差 [31]。Schisandrin B能够干扰紫外线诱导的S期，增加人肺癌细胞对紫外线辐射的敏感性。Wortmannin是弱选择性的ATR抑制剂，实验发现其对ATR的IC₅₀为1.8 μmol/L，而对人肺腺癌细胞A549的IC₅₀ ≥ 10 μmol/L。此外，Wortmannin能增强IR对肿瘤的敏感性，但其毒性大且稳定性差 [33]。

Figure 7. Other ATR like inhibitors

图7. 其他类ATR抑制剂

4. ATR抑制剂联合治疗策略

目前有八种ATR抑制剂正在临床试验中进行评估。虽然单一疗法研究试图利用肿瘤的特殊分子脆弱性，但大多数ATR抑制剂临床试验现在都是联合研究。这与大量临床前研究一致，这些研究支持使用ATR抑制剂作为DNA损伤化疗或放疗、其他DDR抑制剂和免疫检查点抑制剂的增敏剂。这种方法的主要目的是在RS水平升高的情况下抑制ATR，从而抑制癌细胞修复受损DNA的能力。

4.1. ATR抑制剂联合铂化疗

以铂为基础的化疗是许多实体瘤治疗方案的首选。人们普遍认为，铂类药物通过形成体积庞大的铂-DNA加合物(链内和链间交联)发挥细胞毒性作用，从而扭曲DNA的化学结构，导致复制分叉停滞和抑制正常DNA复制 [34]。因此，将ATR抑制剂与铂类药物相结合，以增强铂类化疗对癌细胞的DNA损伤作用。事实上，使用激酶非活性ATR或早期ATR咖啡因和NU6027的一些早期ATR研究表明顺铂具有高度的敏感性 [35]。M6620已与基于铂的化疗联合应用于多种肿瘤类型。例如，在大量非小细胞肺癌细胞系中观察到顺铂体外协同组合，在突变型p53细胞中具有更高的敏感性。当在PDX肺癌模型中进行体内试验时，发现在先前仅使用顺铂或ATR单一疗法无反应时，顺铂和M6620的组合可诱导肿瘤消退。M6620与顺铂和卡铂联合应用于食管癌治疗以及M6620和奥沙利铂联合应用于结直肠癌研究，也证明了可以使用ATR抑制剂作为Pt化疗的增敏剂 [36]。这种组合是很有前景的，因为除了通过形成交联DNA加合物直接破坏DNA外，奥沙利铂还可以诱导免疫原性细胞死亡。Combes等人 [37] 能够证明M6620与奥沙利铂的组合在六种不同的结直肠细胞系和同基因小鼠模型中具有协同作用。ATR抑制也增强了奥沙利铂在体外和体内的免疫原性作用，与单独使用奥沙利铂治疗的小鼠相比，联合使用奥沙利铂治疗的小鼠的CD8阳性T细胞数量增加。AZD6738在非小细胞肺癌、胃癌和头颈部鳞状细胞癌临床前与顺铂联合使用，AZD6738与顺铂联合使用可抑制75%的肿瘤生长，联合用药的两组小鼠对肿瘤生长的抑制作用也与单独使用AZD6738或顺铂的小鼠有显著差异 [37] [38]。与ATM异种移植组相比，ATM缺陷异种移植小鼠接受的AZD6738剂量为AZD6738剂量的一半(25 mg/kg与50 mg/kg，在14天为一个周期的第1~14天口服，在第1天和第8天腹腔内给予3 mg/kg顺铂)这足以使6只小鼠中的3只在联合治疗结束后维持肿瘤消退，这需要进一步评估在生物标记物定义的亚组中是否可以使用低剂量的ATR抑制剂而不影响疗效。由于剂量依赖性毒性，在IGROV-1卵巢癌小鼠模型中，为了维持耐受性，必须将BAY1895344的剂量减少至相当于最大耐受单药治疗剂量的7%或14%。

4.2. ATR抑制剂联合抗代谢药物

ATR抑制剂还与靶向核糖核苷酸还原酶的抗代谢物化疗药物联合使用，目的是增加RS。在一组35个肺癌细胞系中，与M6620共同作用导致近80%的受试细胞系吉西他滨敏感性发生3倍的IC₅₀偏移。只有M6620与顺铂联合使用更有效，近90%的细胞系组实现了IC₅₀的降低。除肺癌外，吉西他滨还用于胰腺癌的治疗，Wallez等人 [38] 将AZD6738与吉西他滨联合使用，在混合的小鼠和人类胰腺癌细胞系中，吉西他滨剂量低至5或10 nmol/L足以使RS增加到对AZD6738敏感所需阈值以上，这包括对AZD6738单一疗法相对耐药的细胞系。进一步的体外研究确定了AZD6738和吉西他滨联合治疗抑制肿瘤细胞生长的最佳调度策略为：同时治疗16小时，然后继续使用AZD6738至少3天。在胰腺癌小鼠模型中采用了类似的治疗时间，与单用吉西他滨相比，联合用药可使肿瘤消退，从而延长生存期，毒性也可接受。在急性髓系白血病的治疗中，也研究了ATR抑制剂和抗代谢化疗的联合应用，VE-821治疗通过S期细胞周期阻滞和增加复制叉停滞，增强了羟基脲和吉西他滨诱导的生长抑制 [39]。在联合治疗的体外原发性急性髓系白血病样本和急性髓系白血病L原位小鼠模型中，反应增强也很明显。

4.3. ATR抑制剂联合拓扑异构酶抑制剂

喜树碱、伊立替康和拓扑替康通过防止与复制叉相冲突的DNA单链断裂的释放，广泛发挥其抗癌作用 [40]。采用RNAi筛选方法，将ATR确定为与拓扑异构酶1抑制剂结合的关键候选物，发现M6620与喜树碱在结直肠癌细胞系中起协同作用，并使结直肠癌小鼠模型对伊立替康的作用敏感。虽然单剂剂量为60 mg/kg的ATR抑制剂对肿瘤生长没有影响，单剂剂量为40 mg/kg的伊立替康仅实现6%的生长消退，但当ATR抑制剂与20 mg/kg伊立替康联合使用时，肿瘤消退率达到55%。与伊立替康单药治疗相比，联合治疗组在体重减轻方面也没有毒性报道 [41]，与单药治疗相比，联合用药的药效可能有助于减缓肿瘤的生长，这需要进一步的临床研究推进。

4.4. ATR抑制剂联合放射疗法

使用ATR利用电离辐射引起的RS和DNA损伤增加是DDR领域的另一个有希望的策略。支持将ATR抑制剂用作肿瘤选择性放射增敏剂的示例包括在胰腺癌中使用VE-821、在食管癌中使用M6620、在三阴性乳腺癌中使用M6620以及在结直肠癌中使用BAY1895344。重要的是，VE-821也被证明在一系列缺氧条件下使癌细胞对放疗敏感，肿瘤内的难以治疗的缺氧区域通常具有抗辐射性。此外，Dillon等人 [42] 对AZD6738对一组癌细胞系、3D肿瘤球体和HCT116 p53的放射增敏效应进行了详细的机理研究，包括消除辐射诱导的G2细胞周期阻滞、降低HRR和产生无着丝粒微核，表明基因组的不稳定性增加。已有一些数据支持放疗可以产生例如通过增加新抗原等有益的免疫介导抗肿瘤反应的理论。ATR抑制剂和放疗联合治疗可以增强肿瘤微环境的免疫调节作用，这可能是一个越来越有前景的领域，需要进一步的机理研究来更好地理解如何利用这些效应，以最大限度地提高肿瘤选择性治疗反应。

4.5. ATR抑制剂联合PARP抑制剂

PARP抑制剂阻断SSB修复，导致RS、复制叉折叠和ATR激活。因此，将这两种DDR关键成分的抑制剂结合起来的原理是，PARP抑制剂诱导的RS需要ATR信号发送到细胞周期检查点以修复损伤。最早的ATR抑制剂之一NU6027被发现至少部分通过抑制HRR使BRCA野生型MCF7乳腺癌细胞对PARP抑制剂鲁卡帕利敏感 [43]。尽管研究之间的机制并不总是一致，但在许多癌症类型中，ATR抑制剂和PARP抑制剂之间存在协同作用。ATR抑制作为克服PARP抑制剂耐药性的一种手段也有了研究。Murai等人 [44] 表明，可以通过与VE-821的联合治疗克服对通过SLFn11的失活(通常通过其在复制叉阻断中的作用形成RS反应的一部分)介导的他拉唑帕利和奥拉帕利的耐药性。VE-821治疗能够使PARP抑制剂耐药的BRCA1缺陷细胞对奥拉帕利治疗重新敏感，这些细胞已恢复HRR功能。目前，ATR激酶抑制剂与PARP抑制剂联合进一步的临床研究已扩展到多个II期试验，包括三阴性乳腺癌、卵巢癌和小细胞肺癌的研究中。

4.6. ATR抑制剂联合免疫检查点抑制剂

将ATR抑制剂与免疫检查点抑制剂相结合是临床试验中的另一种治疗策略。临床前研究探索了DDR增加肿瘤突变压力从而产生新抗原的作用，以提高对免疫检查点抑制的敏感性，复制相关DNA损伤产生的胞浆DNA可能激活干扰素基因环GMP-AMP合酶刺激因子途径，触发先天性免疫反应从而进一步提高联合使用时对免疫检查点阻断的敏感性 [45]。在小鼠结直肠癌模型中M6620与抗PD-L1的抗体阿维鲁单抗和铂类化疗的三重组合评估中，与化疗/阿维鲁单抗治疗组相比，三联体组合具有良好的耐受性，可增强肿瘤生长控制，增加肿瘤消退，提高总生存率 [46]。值得注意的是，那些被发现对三联疗法有完全反应的小鼠随后对第二次肿瘤接种不耐受。

5. 结语

ATR通路作为DNA损伤应答机制中的一种，对于肿瘤的存活起着重要作用抑制，ATR可以诱导ATR通路依赖型恶性肿瘤细胞的死亡，是一种开发低毒且高效靶向抗肿瘤药物的理想靶标。目前已发现多种类型ATR抑制剂，按化合物结构可分为吡嗪类、嘧啶类、吡啶并环类、其他类等，其中有八个化合物已进入临床试验。正在进行临床评估的ATR抑制剂作为单一疗法和联合疗法——不仅与DNA损伤化疗和放疗，还包括其他DNA修复抑制剂和免疫检查点抑制剂。然而，将ATR抑制剂纳入癌症治疗标准还有很长的路要走。两大悬而未决的问题是确定和选择最合适的单一治疗患者组，以及协调适当的剂量，这需要临床试验上进一步的探索。目前，这一领域已取得了显著的成效，竞争程度尤为显著，我们将期待有更多的ATR抑制剂进入临床并成功上市造福人类。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。