1. 引言
肝损伤主要是指肝细胞损伤，其表现为肝脏形态学变化、肝细胞凋亡及肝功能损伤 [1]。是多种肝脏疾病共有的病变结果，药物、酒精、病毒、化学试剂等许多因素都可以诱导肝损伤。肝损伤可以导致脂肪肝、肝硬化、肝纤维化甚至肝癌 [2]。肝损伤主要分为化学性肝损伤和免疫性肝损伤两大类 [3]。
墨旱莲为菊科植物鳢肠Ecliptaprostrata L.的全草，在我国江南各省均有分布，常用中草药，具有滋补肝肾、止血凉血的功效 [4]。是治疗肝病的常用中药 [5]。现代药理表明，墨旱莲有止血、保肝、抗氧化、抗肿瘤、降糖、降血脂、抗菌抗病毒等作用。墨旱莲含有多种化学成分，如三萜类、黄酮类、噻吩类、香豆素类、脂类、甾醇等 [6]。徐汝明等 [7] 通过建立肝损伤的模型，给与小鼠不同剂量的墨旱莲，通过比较小鼠血清ALT (谷丙转氨酶)，MDA (丙二醛)，TP (总蛋白)值的变化，表明了墨旱莲的提取物能够有效改善小鼠的肝损伤。李春洋等 [8] 人通过研究发现，墨旱莲的50%乙醇提取、乙酸乙酯提取物对醋氨酚诱发的小鼠急性肝损伤模型具有保护作用。同时也有报道 [9]，新鲜墨旱莲的乙醇提取物对四氯化碳诱导的大鼠和小鼠肝损伤，呈现明显的肝保护活性，并有剂量依赖性。这些实验及报道均充分说明墨旱莲具有治疗肝损伤的作用，但对于治疗肝损伤的靶点及作用机制仍不明确。
2. 材料与方法
2.1. 化学成分的建立
通过TCMSP数据库，检索“墨旱莲”所有的化学成分，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件 [10]，此条件下默认为该化合物为活性成分，筛选出墨旱莲的活性成分及作用靶点，并通过UniProt数据库将靶点的蛋白名转化成基因名格式，最终建立成分靶点数据集。
2.2. 靶点的筛选与建立
进入GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)，以“liver injury”为关键词筛选与肝损伤相关的基因靶点，将疾病靶点和药物靶点共同导入RStudio1.4.1717中，建立疾病–药物共用靶点数据集。
2.3. 关键靶点PPI网络构建
为了明确墨旱莲治疗肝损伤靶点之间的相互作用，将筛选出的靶点导入String (https://string-db.org/)中，设置种类为“Homosapiens (人类)”构建靶点互作网络图(PPI)，置信度为0.9，隐藏网络中离散点，将结果保存为tsv文件，导入Cytoscape3.6.1中，采用其“NetworkAnalyzer”选项进行分析，确定墨旱莲治疗肝损伤的核心的靶点。
2.4. GO生物过程富集分析和KEGG信号通路
将疾病–药物共有靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行GO生物过程富集分析和KEGG信号通路分析，结果以气泡图的形式进行展示。
2.5. 药物成分与靶点分子对接
TP53的晶体结构(ID: 1h26)、AKT1的晶体结构(ID: 3OCB)、MAPK1(ID: 1PME)下载于RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)，化合物通过TCMSP、PubChem进行下载，并使用SYBYL-X 2.0软件进行能量最小化，并运行SYBYL-X 2.0软件模块中的“Dock Ligand”模块对TP53、AKT1和MAPK1的晶体结构进行对接进行加氢处理、修复侧链、并选择自动处理寻找活性位点等操作。
3. 结果
3.1. 活性成分的筛选
通过检索TCMSP数据库，共得到墨旱莲化学成分48个，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件，共得到活性成分10个，分别为：Linarin (MOL001790)、acacetin (MOL001689)、butin (MOL002975)、1,3,8,9-tetrahydroxybenzofurano[3,2-c]chromen-6-one (MOL003378)、3'-O-Methylorobol (MOL003389)、Pratensein (MOL003398)、demethylwedelolactone (MOL003402)、wedelolactone (MOL003404)、luteolin (MOL000006)、quercetin (MOL000098)，潜在靶点246个，药物靶点删除重复靶点后共有147个，各成分靶点个数具体见表1。
Table 1. Ecliptae Herba active ingredients and target number
表1. 墨旱莲活性成分及靶标数
3.2. 疾病和药物相关靶点的筛选
以“liver injury”为关键词在GeneCards数据库中进行检索，结果显示与肝损伤相关靶基因共8338个，筛选relevance score大于2的靶点，共得到与肝损伤相关的靶基因4431个，采用RStudio1.4.1717对墨旱莲相关靶点和肝损伤靶点进行维恩图的绘制，见图1，得到共有靶点133个，这些靶点包括IL6、TNF、TP53、IL10和CYP3A4等。
Figure 1. Ecliptae Herba target of active ingredient and target of diabetes
图1. 墨旱莲活性成分靶点与糖尿病交集靶点
3.3. 墨旱莲治疗肝损伤的直接作用靶点拓扑参数分析
用String数据库构建关键靶点之间的相互作用图，将墨旱莲治疗肝损伤的共有靶点导入String中，得到蛋白互作网络图(如图2所示)，设置minimum required interaction score为0.9，网络统计得到number of nodes = 133、number of edges = 581、average node degree = 8.74、avg. local clustering coefficient = 0.467、expected number of edges = 196。将结果以TSV格式导出，通过Cytoscape3.9.0获取PPI网络中拓扑参数，采用Cytoscape3.9.0插件“Network Analyzer”共有靶点的Degree、Betweenness centrality和Closeness centrality，结果发现TP53 (Degree = 36)、AKT1 (Degree = 34)、MAPK1 (Degree = 33)、JUN (Degree = 33) 和HSP90AA1 (Degree = 33)等综合排名较前，如图3所示，说明这些靶点在墨旱莲治疗肝损伤中发挥着重要作用。
Figure 3. Protein interaction diagram of top ten targets
图3. 前十靶点蛋白互作图
3.4. GO生物学功能富集分析
为了进一步探讨墨旱莲治疗肝损伤的多重作用机制，将133个共有靶点导入David中进行GO富集分析，共得到GO生物学富集结果555条。其中前3位的富集过程包括positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、positive regulation of transcription，DNA-templated和response to drug。将前20条富集以气泡图的形式展示，其中圆圈的大小表示相关靶点在通路富集的多少，圆圈的颜色越深代表靶点的富集程度，如图4所示，这表明了墨旱莲可能是通过调节这些生物过程而发挥治疗肝损伤。
Figure 4. Bubble chart of enrichment results of GO biological function
图4. GO生物学功能富集结果气泡图
3.5. KEGG通路分析
将133个共有靶点映射到 David 数据库中进行KEGG通路富集分析，将物种定义为“人类”，共得到信号通路121条。通过筛选墨旱莲KEGG富集结果显著性较强的前20条信号通路进行展示，这些通路与墨旱莲治疗肝损伤的作用机制密切相关，如图5所示。其中前5条通路包括Hepatitis B、Pathways in cancer、Bladder cancer、TNF signaling pathway、Prostate cancer等，这些通路大多与TP53、JUN、AKT1和MAPK1等有关。
为了更清晰的展现有效成分、核心靶点与通路之间的关系。利用Cytoscape3.9.0软件将墨旱莲中的成分、共有靶点进行网络进行可视化分析，通过网络药理学构建出墨旱莲治疗肝损伤的交互网络，筛选出相应的交互蛋白，其中绿色椭圆形、三角形和菱形均代表墨旱莲和肝损伤的共有靶点，其中椭圆绿色代表排名前20的靶点，蓝色代表化学成分，共有10个，紫色代表药物，通过构建药物–成分–靶点网络图(图6)，可更直观更清晰地看出各成分对应的靶点调控。
Figure 5. Bubble Diagram of KEGG enrichment results
图5. KEGG富集结果气泡图
3.6. 分子对接结果
基于PPI网络和KEGG富集分析结果，选择墨旱莲和肝损伤共有靶点综合排名较高的关键靶点(TP53、AKT1和MAPK1)进行分子对接，针对这些靶点的活性成分进行分子对接验证，以总打分值(Total Score) ≥ 5为筛选条件 [11] 筛选对接结果较好的化学成分，总打分值越高说明结合较为稳定。墨旱莲相关活性成分包括Linarin、acacetin、butin、1,3,8,9-tetrahydroxybenzofurano[3,2-c]chromen-6-one、3'-O-Methylorobol、Pratensein、demethylwedelolactone、wedelolactone、luteolin、quercetin。最后将对接结果较好的化学成分和蛋白晶体进行可视化，结果如图7所示。结合成分分子的关键靶标的氨基酸残基清晰地呈现出来，氢键用虚线表示。所有化合物的对接评分如下图8所示。结果发现，Pratensein等4个化合物在治疗肝损伤中可能发挥着重要作用。
4. 讨论
中医药有着悠久的历史，将患者视为一个整体。中医整体哲学与新兴网络药理学、网络生物学的核心思想相通，符合应对复杂疾病的需要。但现在的研究仍然侧重于“一个药物，单一靶点、单一途径”。因此有必要进行全面的“多化合物、多靶点和多途径”研究，以阐明墨旱莲如何对肝损伤产生的保肝作用 [12]。本研究基于中医药网络药理学研究方法，对墨旱莲有效部位和活性成分进行筛选，研究其多成分、多靶点对应多个作用通络的作用机制，以阐释其分子间互相作用的内涵。
Figure 6. Component-target-disease network diagram
图6. 化学成分–靶点–疾病网络图
墨旱莲作为临床保肝常用药，且疗效可靠 [13]，具有治疗肝损伤的作用，但其作用机制尚不明确。徐汝明等 [14] 人研究发现，对墨旱莲有效活性成分进行体外筛选，获得有效活性成分蟛蜞菊内酯(属香豆素类化合物)，这提示墨旱莲中的蟛蜞菊内酯可能是治疗肝损伤的有效化合物。Saxena等人 [15] 等研究表明，墨旱莲可能的机制是与肝微粒体药物代谢酶的调控有关。Luo Qingqiong等人 [16] 研究表明墨旱莲中的蟛蜞菊内酯可降低ConA诱导的肝炎小鼠的肝脏炎症和肝细胞凋亡，并降低白细胞浸润和T细胞活化。Pornpen PRAMYOTHIN等 [17] 人的研究表明，墨旱莲治疗肝损伤的机制可能与其抗氧化活性有关。
Figure 7. Visualization of molecular docking
图7. 分子对接可视化
排名前三的关键靶点TP53、MAPK1和AKT1参与了肝损伤的发生发展，如TP53基因是一种抑癌基因，在通常情况下p53蛋白的活性很低，当机体遇到DNA损伤时，p53的活性和表达水平则会迅速升高 [18]。TP53通过凋亡途径抑制肝癌的生长 [19]。AKT1能过促进肝细胞生长因子和血管内皮生长因子的上调，并在炎症环境下释放更多的抗炎细胞因子和生长因子，使其在免疫介导的肝炎中发挥保护作用 [20]。通过Kegg富集分析，得到前5的信号通路为Hepatitis B (乙型肝炎)、Pathways in cancer、Bladder cancer、TNF signaling pathway和Prostate cancer。其中Hepatitis B富集结果显著性较大，这说明墨旱莲可能对病毒性肝炎都具有抑制作用。乙肝病毒是一种包含部分双链松弛环状 DNA基因组的包膜病毒，进入肝细胞后，HBV RC-DNA被转运至细胞核，转化为共价闭合环状分子cccDNA。PgRNA与病毒聚合酶蛋白相互作用以启动核心颗粒的衣壳化。通过内质网，核心颗粒与包膜蛋白完成组装并被释放。HBV感染后可导致广泛的肝脏相关疾病，如慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等，但其造成肝损伤的机制仍不清楚 [21]。
5. 结论
综上所述，墨旱莲治疗肝损伤的机制可能与乙肝、肝癌和炎症相关通路密切相关。网络药理学是一种通过分析生物系统网络来探索中药潜在靶点和途径的有效方法，为下一步的实验研究提供方向。
基金项目
贵州省高层次创新型人才项目(千层次2014)；贵州省科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020]5010)；贵州省发改委工程研究中心建设项目(黔发改高技(2020)896号)。
NOTES
*通讯作者。