摘要:
目的：基于网络药理学方法分析吉贝咳喘胶囊有效成分抗菌抗病毒作用在治疗急性加重慢性阻塞性肺疾病(AECOPD)中的作用机制研究。方法：通过CNKI、TCMSP、SwissTargetPrediction、化源网等数据库检索搜集并筛选吉贝咳喘胶囊中吉祥草、黄芩、浙贝母、蛤壳、毛大丁草、麻黄、桑白皮、葶苈子、天竺黄、僵蚕、地龙11味中药的主要成分及靶点信息，用Cytoscape3.8.0软件构建药物–成分–靶点网络；通过GeneCards数据库搜集抗菌、抗病毒的相关靶点信息；借助Venny在线平台分析共有交集靶点并绘制韦恩图；通过STRING平台进行蛋白质相互作用分析，构建PPI网络；通过David数据库进行GO分析及KEGG信号通路富集分析(P < 0.05)。结果：共筛选获得吉贝咳喘胶囊161个主要成分、883个靶点，抗菌、抗病毒相关靶点6465个，共同交集靶点537个，筛选核心潜在靶点有ATK1、MAPK3、RELA、NF-κB1、PAK3CA、MAPK1、MAPK14、MAPK8、TNF等34个；获得GO生物过程358条、KEGG信号富集通路103条，主要涉及PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路等。结论：本研究结果表明，吉贝咳喘胶囊可能通过各药材的活性成分作用于ATK1、MAPK3、RELA、NF-κB1、PAK3CA、TNF等关键靶标参与PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路联合发挥抗菌、抗病毒作用，充分体现了吉贝咳喘胶囊在治疗AECOPD中多成分、多靶点、多通路的抗菌、抗病毒作用机制，为进一步深入阐明吉贝咳喘胶囊作用机制提供理论参考。
Abstract:
Objective: To analyze the mechanism of antibacterial and antiviral effects of effective components of JibeiKechuan Capsule in the treatment of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (AECOPD) based on network pharmacology. Methods: The main components and target information of 11 traditional Chinese medicines in JibeiKechuan capsule were collected and selected by CNKI, TCMSP, SwissTargetPrediction and Huayuan.com databases. Cytoscape3.8.0 software was used to construct a drug-component-target network. GeneCards database was used to collect antibacterial and antiviral target information. The Venny online platform was used to analyze common inter-section targets and draw A Venn diagram. Protein interaction analysis was conducted through STRING platform to build PPI network. GO analysis and KEGG signal pathway enrichment analysis were performed by David database (P < 0.05). Results: A total of 161 main components, 883 targets, 6465 antibacterial and antiviral related targets and 537 common intersection targets of JibeiKech-uan capsule were screened. 34 potential targets were screened, including ATK1, MAPK3, RELA, NF-κB1, PAK3CA, MAPK1, MAPK14, MAPK8 and TNF. 358 GO biological processes and 103 KEGG signal enrichment pathways were obtained, mainly involving PI3K/Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, T cell receptor signaling pathway, TNF signaling pathway, etc. Conclusion: The results of this study indicate that JibeiKecchuan capsule may be involved in PI3K/Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, T cell receptor signaling pathway and TNF signaling pathway by acting on ATK1, MAPK3, RELA, NF-κB1, PAK3CA, TNF and other key targets through the active ingredients of various medicinal materials. The effect of virus fully reflects the antibacterial and antiviral mechanism of JibeiKechuan capsule in the treatment of AECOPD with multiple components, multiple targets and multiple pathways, providing theoretical reference for further elucidating the mechanism of Action of JibeiKechuan capsule.
1. 前言
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的严重致残的慢性肺部疾病，易合并肺部感染，临床多表现为咳嗽、咯痰、气促、喘息、胸闷等症。目前已成为全球第三大致死性疾病，仅次于缺血性心脏病和卒中，其病因复杂，发病机制复杂、危险因素众多。由感染引起的呼吸道炎症是诱发COPD患者疾病急性加重的主要原因之一，当患者受到病毒、细菌感染等原因诱发后出现咳嗽加重、痰液量增多，或出现黄痰、浓痰等症时，此期即为慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD) [1] [2] [3]。吉贝咳喘胶囊作为贵阳中医学院第二附属医院自制中成药，以吉祥草、黄芩、浙贝母、蛤壳、毛大丁草、麻黄、桑白皮、葶苈子、天竺黄、僵蚕、地龙11味中药组成，具有清热宣肺、化痰散结、平喘止咳的功效。方中君药吉祥草是我国西南苗族地区常用的传统草药之一，现代研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎、祛痰镇咳、解痉平喘等作用 [4] [5]；同时方中黄芩、浙贝母、毛大丁草提取物及其活性成分具有广泛的抗病毒活性，可有效抑制多种危险病毒，作用靶点多样，对病毒感染的各个阶段均有干预作用 [6] [7] [8]。目前课题组获得专利表明其对肺炎链球菌、卡塔双球菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用和杀菌作用，能抑制流感病毒 [9]。临床证明口服吉贝咳喘胶囊能有效提高AECOP及其肺胀痰热郁肺证患者的治疗率 [10] [11]。但其具体作用机制不清楚，因此，本文基于网络药理学方法分析吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒作用在治疗AECOPD中的作用机制研究。为进一步深入阐明吉贝咳喘胶囊作用机制提供理论参考。
网络药理学(Network pharmacology)是最初由Hopkins在2007年提出的一门新兴学科，是指在网络数据库快速发展的背景下，通过系统观察药物对疾病的干预和影响，预测药物的致病作用机制，并从整体的角度来阐述复方与机体之间的相互作用，揭示“复方–多成分–多靶点–疾病”网络关系 [12] [13]。
2. 方法
2.1. 吉贝咳喘胶囊相关靶点筛选及药物–成分–靶点网络构建
通过中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP https://tcmsp-e.com)、CNKI、化源网、SwissTargetPrediction等检索吉贝咳喘胶囊各味中药的所有化合物成分，根据口服生物利用度(Oral bioavailability, OB) ≥ 30和类药性(Drug likeness, DL) ≥ 0.18为ADME属性值及对活性成分进行筛选，得到吉贝咳喘胶囊11个中药的161个有效成分，并利用化学成分进行检索，得到相应的蛋白质靶点。筛选结束后，运用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)查询并规范相对应的官方基因名称(official gene symbol)，合并并删除重复值。运用Cytoscape3.8.0软件构建“药物–成分–靶点”网络，利用Cytoscape3.8.0软件中的“Network Analyzer”进行拓扑属性分析。
2.2. Antibacterial、Antiviral相关靶点预测及韦恩图制作
通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/Guide/Publications)，以“anti-bacterial、anti-viral、Antibacterial and antiviral”为关键词检索与抗菌、抗病毒相关的疾病靶点，合并靶点并删除重复值，建立相关疾病基因靶点数据集。通过Venny在线制作平台(Venny 2.1.0 (sic.es)c)将药物基因靶点和疾病基因靶点相映射，绘制韦恩图并获得药物–疾病交集基因靶点。
2.3. PPI网络的构建与分析
将药物–疾病交集基因靶点导入到STRING11.5数据库(https://string-db.org)中构建蛋白相互作用网络，设置物种种类为“Homesapiens”(人类)，最低互相作用阈值设置为“high confidence”(>0.900)，隐藏网络中未连接的节点，其余均为默认值，得到PPI网络图和TSV文件，将TSV文件导入Cytoscape3.8.0软件中，构建PPI网络，进行拓扑属性分析，筛选核心靶点信息。
2.4. 疾病靶点功能与通路的富集分析
为了进一步了解药物–疾病的潜在治疗基因靶点的功能和在信号通路中发挥的作用，将交集基因靶点导入DAVID数据库(DAVID: Functional Annotation Tools (ncifcrf.gov))，物种种类设置为“Homesapiens”(人类)，设置P < 0.05，进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO分析选择生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。利用微生信在线云平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO富集分析分类柱状图、气泡图和KEGG信号通路富集分析气泡图。
3. 结果
3.1. 吉贝咳喘胶囊活性成分的获取
通过CNKI、TCMSP、SwissTargetPrediction、化源网数据库检索得到吉贝咳喘胶囊各中药成分，以OB ≥ 30，DL ≥ 0.18为ADME属性值对药物成分进行筛选，共筛选出161个(其中有11个成分为两种或两种以上中药共有)活性成分，其中吉祥草12个、黄芩32个、浙贝母5个、蛤壳4个、毛大丁草22个、麻黄22个、桑白皮24个、葶苈子9个、天竺黄8个、僵蚕33个、地龙11个。检索药物靶点基因得到3578个，删除重复值得到吉贝咳喘胶囊药物靶点基因883个。
3.2. 药物–成分–靶点网络的构建和分析
运用Cytoscape3.8.0软件构建吉贝咳喘胶囊药物–成分–靶点网络图，见图1。该网络包含1052个节点(node)，3692条边(edge)，圆形代表药物，六边形代表化合物成分，菱形代表靶点基因。利用“Analyze network”功能对网络进行拓扑属性分析，度值(Degree)越大表示该节点越重要。在药物–成分–靶点网络中，度值(Degree)排名前15位的化合物见表1。
Table 1. Chemical composition of the top 15 in Degree
表1. Degree排名前15名的化学成分
Figure 1. “drug-component-target” network of JibeiKechuan Capsule
图1. 吉贝咳喘胶囊“药物–成分–靶点”网络
3.3. 吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒的潜在治疗靶点
通过GeneCards数据库检索抗菌、抗病毒相关靶点，合并及删除重复值后共得到疾病靶点6771个，通过Venny在线平台将药物靶点和疾病靶点相映射，共得到交集靶点537个，见图2。
Figure 2. Venny diagram of potential antimicrobial and antiviral targets of JibeiKechuan Capsule
图2. 吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒潜在靶点Venny图
3.4. PPI网络的构建和分析
将获得的537个交集靶点上传至STRING11.5平台，最低互相作用阈值设置为“high confidence”(>0.900)，隐藏未参与的节点，将保存的TSV文件导入Cytoscape3.8.0软件中进行拓扑属性分析，共获得451个节点、2866条边，平均度值25.4，按照度值进行排布，度值 > 60的节点有46个。度值越大证明该节点在网络中的位置越关键，作用越重要。得到吉贝咳喘胶囊的潜在靶点蛋白相互作用网络(PPI)，见图3。
Figure 3. PPI network of potential antimicrobial and antiviral targets of JibeiKechuan Capsule
图3. 吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒潜在靶点PPI网络
3.5. GO富集分析和KEGG信号通路富集分析
将PPI网络中排名34名(Degree ≥ 70)的潜在治疗靶点映射到DAVID数据库，共得到GO富集条目358条(P < 0.05)，包括264个生物过程(biological process, BP)、32种细胞组分(cellular component, CC)、62类分子功能(molecular function, MF)。GO富集分析柱状图见图4 (绿色表示BP、黄色表示CC、紫色表示MF)。BP方面主要富集在药物反应、细胞凋亡、细胞增值与聚集、peptidyl-tyrosine自身磷酸化、基因转录，信号通路、信号调节等；MF主要富集在蛋白结合、ATP结合、转录因子结合、转录调节区DNA结合、蛋白酶绑定等；CC主要富集在细胞膜、细胞器、核浆、质膜、胞质、蛋白质复合体、细胞外的外来体等。将富集排名前10条目分别用柱形图和气泡图表现，见图4和图5。
Figure 4. Histogram of GO enrichment analysis
图4. GO富集分析柱形图
KEGG信号通路富集分析共得到103条通路(P < 0.05)，涉及PI3K/Akt信号通路、催化激素信号通路、破骨细胞分化通路、乙型与丙型肝炎、MAPK信号通路、toll样受体信号通路、趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路、生产信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。选取富集排名前30的信号通路用柱形图和气泡图表示，见图6和图7。
Figure 5. Bubble diagram of GO enrichment analysis
图5. GO富集分析气泡图
Figure 6. Histogram of KEGG enrichment analysis
图6. KEGG富集分析柱形图
Figure 7. KEGG enrichment analysis bubble diagram
图7. KEGG富集分析气泡图
3.6. 通路–靶点网络的构建和分析
根据文献检索 [14] [15] [16] [17] 发现与抗菌、抗病毒相关的信号通路有：PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，此结果与上述KEGG信号通路富集分析结果一致。故选取关键通路，利用Cytosape3.8.0软件构建“靶点–通路”网络，见图8 (蓝色圆形表示通路，紫红色菱形表示靶点)。
4. 讨论
通过数据库检索吉贝咳喘胶囊药物–成分–靶点网络拓扑属性分析发现，度值(Degree)排名前15位的化合物分别为：quercetin (槲皮素)、H-Leu-Phe-OH (亮氨酰苯丙氨酸)、arachidonic acid (花生四烯酸)、beauverolide E (白僵菌环缩醇酸肽 E)、beauverolide D (白僵菌环缩醇酸肽 D)、beauverolide C (白僵菌环缩醇酸肽 C)、beauverolide A (白僵菌环缩醇酸肽 A)、6-Acetyl-2,2-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1- benzopyran(6-乙酰基-2,2-二甲基-8(3-甲基-2-丁烯基)-2H-苯并呋喃)、beauverolide H (白僵菌环缩醇酸肽 H)、Piloselloidal (毛大丁醛)、Palmitoleic acid (棕榈酸)、erythritic acid (赤癣酸)、Oleic acid (油酸)、Linoleic acid (亚油酸)、Kaempferol (山柰酚)。作为黄酮类化合物的山柰酚槲皮素具有较强的体内外抑菌作用与广谱抗菌性，槲皮素是一种植物源杀菌剂 [18]。可通过调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核因子κB (NFκB)信号通路抑制炎性细胞因子及人单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)等的释放 [19]，花生四烯酸(AA)是人体必需脂肪酸，在抗菌、抗炎症、抗癌、等方面具有独特的生物活性 [20]，上述成分的研究充分说明吉贝咳喘胶囊通过多成分联合发挥抗菌、抗病毒作用。
Figure 8. “pathway-target” network of JibeiKechuan Capsule
图8. 吉贝咳喘胶囊“通路–靶点”网络
通过对吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒的蛋白相互作用网络(PPI)结果分析，共有451个靶点基因，拓扑分析发现吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒的潜在关键靶点有：SRC、MAPK3、JUN、TP53、MAPK1、STAT3、ATK1、PIK3CA、IL6等36个关键核心靶点，度值均≥70。利用DAVID数据库对吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒关键靶点基于生物学过程(BP)、分子功能(CC)和细胞组成(MF)进行GO分析以及KEGG分析，结果表明，这些靶点主要分布在药物反应、细胞凋亡、细胞增值与聚集、peptidyl-tyrosine自身磷酸化、基因转录，信号通路、信号调节、蛋白结合、ATP结合、转录因子结合、转录调节区DNA结合、蛋白酶绑定、细胞膜、细胞器、核浆、质膜、胞质、蛋白质复合体、细胞外的外来体等。PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、T细胞受体信号通路等为吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒的关键通路。
Toll样受体是一种模式识别受体，通过识别病原微生物进化中保守的抗原分子，快速激活胞内的信号介质—白介素受体相关蛋白激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子、促分裂原活化蛋白酶和κＢ激酶等的表达。Toll样受体信通路是机体抵抗感染性疾病的重要防线，Toll样受体2、4信号通路处于活化状态，可增加下游炎性因子释放，参与COPD炎症过程 [21]。PI3K-Akt信号通路的激活可干扰P38MAPK下调MUC基因转录，抑制PI3K/Ak信号通路能够有效降低MUC5AC蛋白的表达 [22]，有研究提示COPD及AECOPD大鼠、患者IL6水平与MUC5AC等气道黏蛋白正相关 [23] [24] [25]；而MAPK途径亦可通过配体依赖的方式来诱导MUC的合成 [26]。肾方能下调NEDD4的表达，进而通过上调PTEN并且下调PI3k/AKT通路，并减少下游炎症因子的释放，很可能是治疗COPD的机制之一 [27]。相关研究表明T淋巴细胞亚群失衡导致机体免疫功能失调与COPD进展密切相关，T淋巴细胞及其趋化因子介导的炎症反应和机体免疫功能失衡密切相关，起着正反免疫调控作用 [28]。
5. 结论
综上所述，本研究通过网络药理学方法阐述了吉贝咳喘胶囊通过多成分、多靶点、多通路发挥抗菌、抗病毒作用的机制，为吉贝咳喘胶囊抗菌、抗病毒发挥作用提供了理论支持。为进一步阐明其抗菌、抗病毒成分及作用机制提供理论参考。网络药理学作为研究中医中药的一种新方法，目前仍缺乏相关实验验证和临床验证，因此其具体治疗机制还有待进一步研究。
基金项目
贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(项目合同编号：黔科合中专[2004] 44号)，贵阳市科技局中药现代化专项(项目合同编号：[2007]筑科农合同字第3-1号)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。