电化学及光电化学传感器检测胱抑素C的研究进展

Research Progress on Detection of Cystatin C by Electrochemical and Photochemical Sensors

摘要: 胱抑素C是一种由有核细胞合成的碱性低分子量蛋白，相比肌酐而言，胱抑素C能够更加敏感地反映肾脏受损情况，尤其在CKDI、II时期。现存的胱抑素C临床检测方法，因价格昂贵、操作复杂、灵敏度低等原因在临床受限。但近几年兴起的电化学、光电化学传感器体系检测胱抑素C，有效地弥补了以往的检测缺陷，且能达到床旁快速检测的目标，本文就电化学、光电化学传感器体系检测胱抑素C的研究进行综述。

Abstract: Cystatin C is an alkaline low-molecular-weight protein synthesized by nucleated cells. Compared with creatinine, cystatin C is more sensitive to renal damage, especially in CKD stages I and II. Existing cystatin C clinical detection methods are limited due to high cost, complex operation and low sensitivity. However, in recent years, the emergence of electrochemical and photoelectric sensor systems to detect cystatin C has effectively made up for the defects of the previous detection, and can achieve the goal of rapid detection near the bed. This paper reviews the research on the detection of cystatin C by electrochemical and photoelectric sensor systems.

1. 引言

胱抑素C (cystain C)是一种分子量为13 kDa的非糖基化小分子蛋白 [1]。有核细胞均能产生，无组织特异性。相比肌酐而言，胱抑素C能更加敏感地反映肾脏受损情况，尤其在CKDI、II时期。因此实现胱抑素C的快速床旁检测有重大临床意义。电化学及光电化学传感器体系具有操作简单、快速、灵敏等优点，刚好弥补传统胱抑素检测方法的缺点。本文就电化学、光电化学传感器体系检测胱抑素C的研究进行综述。

2. 胱抑素的临床意义

胱抑素C完全被肾小管上皮细胞重吸收并在细胞内降解，不再进入血液循环；同时，肾小管上皮细胞也不主动分泌胱抑素C [2]。因此，肾脏成了胱抑素C的唯一清除器官。通常情况下，胱抑素C血清浓度主要由肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)决定。现临床通常通过测定血肌酐来计算GFR，该方法除受近曲小管分泌肌酐的干扰外，还会受年龄、性别、体重和身高等因素的影响，计算出的GFR与真实值存在较大偏差 [3]。重要的是肌酐对于早期肾功能损害的敏感度较低 [4]，无法及时在CKDI、II期被检测到。然而，胱抑素C却可以。

胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物 [5]。有研究表明，在出生12个月后胱抑素C便不受性别、年龄、体重甚至炎症等因素的影响 [6]。即使曾有研究表明胱抑素C水平可能受到非肾脏疾病的影响，如皮质类固醇、甲状腺功能障碍、肥胖、糖尿病等即便如此，但它仍比血肌酐作为反映肾小球滤过率的指标更准确 [7]。

此外，老年骨折住院患者的骨骼肌质量下降非常快，肌酐作为肌肉代谢的分解产物，会随着肌肉质量的减少而降低 [8]。因此，住院期间老年患者的肌酐水平不能很好反映这部分患者的肾功能。与此相反的是，在已经被验证了的基于胱抑素C来估计GFR的公式 [9]，能反映住院老年患者的GFR。Nakhjavan-Shahraki [10] 等也证实在预测儿童急性肾损伤方面胱抑素C比肌酐具有更敏感的价值。

3. 胱抑素C的常见检测方法

目前临床上常用的胱抑素C检测方法大致分为均相、非均相检测两大类 [11]，具体见表1。

从表1中可以看出，放射性免疫测定法、EIA等虽操作简便，但灵敏度、下限较差，且检测时间长，故不适用于临床推广。颗粒增强透射免疫比浊法及颗粒增强散射免疫比浊法灵敏度稍好，出结果时间短，能全自动化，但下限及灵敏度仍有待改进，且价格昂贵。临床急需一种集快速、简便、灵敏度高、成本低等优点于一身的检测方法。

Table 1. Existing common cystatin C detection methods

表1. 现有的常见胱抑素C检测方法

4. 电化学方法

电化学分析法是利用物质的电学、电化学性质及其变化而建立起来的分析方法，是研究电能和化学能相互转换的科学 [12]。在此基础上形成的电化学生物传感器是将待测物通过其特有的反应转换为电信号的传感器 [13]。电化学生物传感器有不同的分类，其中免疫传感器是检测蛋白质最常用的种类，原理为以抗原抗体免疫反应为基础，电化学检测系统作为换能器，从而实现对目标物的检测 [14]。电化学法检测快速、便捷、价格亲民，完美符合临床床旁检测要求。

近年来，已有报道用电化学传感器法检测胱抑素C。Erika K.G等在2019年建立了一种由氧化石墨烯-二茂铁纳米膜为介导从而产生电流相应的传感器，将抗胱抑素C抗体的Fc部分固定在滴注的聚乙烯亚胺膜上，以提高检测的灵敏度和重复性 [15]。氧化还原是电化学检测中必不可缺的一部分，传统的方法是将氧化还原物质添加到电解质液中，但这样的缺点是在清洗电极等过程中检测信号会延迟 [16]。作为稳定性好的氧化还原活性分子，二茂铁可以附着在传感器表面，成为电化学活性的中心，免去了传统免疫传感器中使用的，外部氧化还原探针 [17]。氧化石墨烯是一种导电性好、比表面积的纳米材料，易生产，能与蛋白质的某些基团反应 [18]。Erika K.G利用氨基二茂铁活化氧化石墨烯构建了一种不使用氧化还原探针的传感器，用该传感器实现胱抑素C的快速检测。该传感器平台对CysC的响应范围为0.1~1000 ng/mL，检测下限(0.03 ng/mL)较传统检测方法，如酶联免疫、荧光免疫测定法等有大的提升，传感器的准确、特异性也较好，为未来现场检测提供了一个有前途的候选方案。但传感器体系较简单，无放大催化效应。

2020年K. S. Shalini Devi团队，利用氧化石墨烯–壳聚糖(GO-Chit)纳米复合材料的分散性对碳工作电极进行修饰，使CysC抗体具有较高的偶联率，传感器体系更为稳定、灵敏，且弥补了Erika K.G构建的传感器干扰信号大这一缺点。传感器的检测范围：1~10 mg/L，检出限：0.0078 mg/L [19]，能灵敏、特异性的检测出胱抑素C。

5. 光导电化学发光法

光电化学生物传感是一种在生物医学和环境监测等领域具有实际应用潜力的新兴传感技术。该传感技术是基于光响应材料受光照激发后产生的光生电荷与待测物质直接或间接发生氧化还原反应引起电学信号的变化实现对待测物的定性或定量分析 [20]。与电化学生物传感器相比，光电化学生物传感器不仅有经济、灵敏、便携等优点，而且由于分析过程中将激发信号与检测信号完全分开，即以“光激发–电检测”的模式工作，显著降低了背景噪音，与单独电化学方法相比具有更高的检测灵敏度以及更低的检出限的特点 [21]。

2016年Li Mi创建了一种基于TiO₂纳米管阵列的简单灵敏的光电化学免疫传感器用来检测胱抑素C。制备的TiO₂纳米管阵列在光照下表现出高而稳定的光电流响应。将胱抑素C特异性纳米抗体与TiO2纳米管阵列偶联后，用于跟踪胱抑素C与特异性纳米抗体之间的免疫反应引起的光电流变化，从而定性、定量地检测胱抑素C含量 [22]。此传感器可在0.72 pM至7.19 nM的校准范围内测定CysC，在0.72 Pm~3.6 nM范围内光电流变化与CysC浓度的对数呈线性关系，检测下限为0.14 pM，远远低于2019年Anne-Sophie Bargnoux通过增强散射免疫比浊法检测胱抑素C时的检测下限(0.043 mg/L) [23]。显示出该免疫传感器令人满意的检测内、检测间准确性，还具有高选择性、稳定性。该体系的纳米抗体也不失为一大亮点，相比于常规抗体，纳米抗体是最小的抗原结合片段，甚至能穿透血脑屏障，稳定性较好。最重要的是，纳米抗体的C末端可用于高亲和力和特异性共价和定向结合抗原 [24]，从而使检测信号变得稳定、灵敏。同时该策略为推广CysC的诊断提供新的思路。

6. 总结

胱抑素C是较好评价肾功能的临床指标，对于老年、儿童等特殊年龄患者，胱抑素在评估肾功能时，明显优于血肌酐。以往常用的胱抑素C检测方法，存在价格昂贵、需专业技术人员、灵敏度低等缺点。电化学及光电化学传感器检测方法简单且易上手、价格低下，且能实现随时、随地检测，非常适用于快速床旁检测。但目前报道较少，传感器体系建立也较少，未来应继续在已有的基础上探索，建立信号稳定且灵敏度高的传感器。

NOTES

^*通讯作者。