1. 引言
着色性干皮病(xerogpimentosum, XP)是一种常染色体隐性遗传病,是经紫外线照射后皮肤发生光敏感,继而出现皮肤脱屑、褐色斑点及斑块,甚至可致皮肤癌、眼部损伤及内脏肿瘤的1种罕见疾病 [1] [2]。XP是第一个被发现的与损伤DNA修复缺陷有关的疾病 [3],可累及各种族人群,以日本人和中东人发病率最高。通过细胞融合技术发现,将不同XP患者的成纤维细胞相互融合形成的杂种细胞可以重新获得损伤DNA修复的能力,提示我们XP具有多型性且各型之间互补 [4]。美国国家生物技术信息中心(The National Center for Biotechnology Information, NCBI)的生物医学信息检索系统PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)目前显示涉及XP的致病基因包括XPA、XPB(ERCC3)、XPC、XPD(ERCC2)、XPE(DDB1)、XPF(ERCC4)、XPG(ERCC5)、XPH(POLH)、XPI(ERCC1)。角化棘皮瘤(keratoacanthoma)是一种生长迅速的皮肤肿瘤,好发于中老年 [5]。本研究对确诊的1例XP伴眼周角化棘皮瘤患者的临床、组织病理学以及基因学特点进行分析,旨在探讨着色性干皮病的基因认识以及角化瘤的病理。
2. 研究对象与方法
2.1. 研究对象病史采集
研究对象为常州市中医院就诊的1个着色性干皮病患者(图1)。生活在江苏常州,71岁女性,否认家族史,否认近亲结婚史。临床表现为面部可见大小不等、形状不规则的褐色色素沉着斑及色素脱失斑,左眼下睑下方近鼻根部,2个月内迅速长出一条状肿物垂直于皮肤面,状如香烟,大小为18 mm × 4 mm × 4 mm,其根部皮肤轻度红肿,皮肤表面见灰褐色斑片,肿物边界清晰。双眼鼻侧球结膜及其下组织增生至角膜缘内约5 cm,颈部宽约4 cm。双眼晶状体浑浊。本研究严格遵循赫尔辛基宣言,所有研究均征得患者的知情同意。
2.2. 实验方法
2.2.1. 手术切除肿物以及标本处理
行左眼下睑皮肤新生物切除 + 皮瓣修补术。切除肿物长度约2 cm,切面呈灰褐色,质硬。切除的标本经4%甲醛固定,常规脱水、包埋、切片、脱蜡,苏木精–伊红(HE)染色,于光镜下观察。术后一周复查拆线并进行电话随访。
2.2.2. 外周血DNA提取
采用苯酚/氯仿/异戊醇法提取外周血中基因组DNA,并对DNA进行质量检测:① 取5 μL DNA溶液1%琼脂糖、1 × TAE缓冲溶液电泳(电压120~180 V)检测,单一条带说明DNA完整无降解,有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求;② Nanodrop测定所有血样DNA浓度和纯度,取OD260/OD280比值1.6~1.9纯度要求的DNA。将DNA浓度稀释到50 μg/ml,登记后放入−20℃冰箱保存备用。
2.2.3. 引物设计
设计引物软件用Primer Premier 5,一般参数:引物长度在18~30 bp;Tm值在55~65度,退火温度在60℃左右;GC含量40%~70%;要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在;PCR扩增产物长度:位点测序引物在150~300 bp左右,外显检测引物离外显子上下游150 bp左右;目的基因测序的PCR产物条带一般不超过1200 bp。
2.2.4. XP基因序列扩增
突变筛查采用高通量测序技术对9个遗传性XP相关基因(XPA、XPB(ERCC3)、XPC、XPD(ERCC2)、XPE(DDB1)、XPF(ERCC4)、XPG(ERCC5)、XPH(POLH)、XPI(ERCC1))进行突变筛查,用NextSeq500 (美国Illumina公司)测序仪进行高通量测序。从GenBank获取基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。引物软件用Primer Premier 5设计引物,引物序列见表1~9。
采用PCR法扩增其编码区,引物序列和PCR退火温度。以基因组DNA为模板,通过PCR反应对目的片段进行扩增。PCR反应体系为30 μl,包括模板基因组DNA1μl (50 ng/μl),10 × Buffer缓冲液5 μl,10 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTP) 5 μl,Taq DNA聚合酶0.25 μl,上、下游引物各0.5 μl (10 mmol/L)。反应条件为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,退火63℃~53℃ 30 s,72℃延伸45 s,共20个循环。电泳检测PCR产物(图1)。将PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序仪为3730DNAsequencer。进行双向测序;对正向测序发现双峰或杂峰及BLAST后DNA变异样本进行2次独立PCR产物正反向测序予以验证。
2.3. 序列比对以及突变分析
将上述基因片段的测序结果与Genebank中获取XP基因序列进行比对,使用DNAstar软件(DNASTAR Inc, Madison, WI)中SeqMan程序进行分析。用Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/)在线生物信息学软件分析突变位点序列的保守性以及变异是否有害。
3. 结果
3.1. 组织病理学检查结果
切除肿物送组织病理学检查结果示,表皮角化过度,真皮浅层慢性炎性细胞浸润,HE染色镜下见肿物表面过度角化,边缘表皮增生向中央包绕,底部呈假上皮瘤样增生,形成不规则的上皮团块及角化物,肿物与周围界限清楚,周围间质内可见大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及组织细胞浸润(图2)。患者术后半年电话随访肿物未复发。
3.2. 基因测序结果
经基因序列分析发现,在XP基因外显子内,该患者cDNA碱基出现改变(图3~7)。检测到的突变分别位于cDNA的:
XPB基因第14外显子的第260位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由A变为G,导致编码的氨基酸由赖氨酸(Lys, K)变成精氨酸(Arg, R) (图3);第14外显子的第312位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由A变为G,突变前后编码的氨基酸不变,该突变为无义突变(图4);
XPC基因第8外显子的第39位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由T变为C,突变前后编码的氨基酸不变,该突变为无义突变(图5);第9外显子的第506位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由T变为C,导致编码的氨基酸由亮氨酸(Leu, L)变成丝氨酸(Ser, S) (图6);第16外显子的第211位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由A变为C,导致编码的氨基酸由丝氨酸(Ser, S)变成精氨酸(Arg, R) (图7);
XPD基因第6外显子的第108位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为A,突变前后编码的氨基酸不变,该突变为无义突变(图8);
XPF基因第11外显子的第488位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为T,导致编码的氨基酸由脯氨酸(Pro, P)变成亮氨酸(Leu, L) (图9);
XPG基因第2外显子的第50位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为T,导致编码的氨基酸由苏氨酸(Thr, T)变成甲硫氨酸(Me) (图10);第4外显子的第48位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为T,突变前后编码的氨基酸不变,该突变为无义突变(图11);第8外显子的第108位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,导致编码的氨基酸由亮氨酸(Leu, L)变成缬氨酸(Val) (图12);第15外显子的第346位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,导致编码的氨基酸由苏氨酸(Thr, T)变成甲硫氨酸(Met) (图13);
XPI基因第3外显子的第33位碱基,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为T,突变前后编码的氨基酸不变,该突变为无义突变(图14)。
MutationTaster在线生物学信息软件对以上7个错义突变分析,得出“phylop”和“phastcons”值(phylop为正数即保守,数字越大越保守,负数即不保守。phastcons是一个0~1的值,越接近1越保守,越接近0越不保守。)
XPB基因第14外显子,c. 260A > G (p. Lys 87 Arg),“phylop”和“phastcons”值分别为“−0.609”和“0”。该位点序列不保守,变异对蛋白影响不大。
XPC基因第9外显子,c. 506T > C (p. Leu169Ser),“phylop”和“phastcons”值分别为“0.207”和“0.995”。该位点序列保守,变异为有害突变。
XPC基因第16外显子,c. 211A > C (p. Ser 71 Arg),phylop”和“phastcons”值分别为“0.897”和“1”。该位点序列保守,变异为有害突变。
XPF基因第11外显子,c. 488C > T (p. Pro 163Leu),phylop”和“phastcons”值分别为“−4.574”和“0”。该位点序列不保守,变异对蛋白影响不大。
XPG基因第2外显子,c. 50C > T (p. Thr17Met),phylop”和“phastcons”值分别为“−0.189”和“0.978”。该位点序列不保守,变异对蛋白影响不大。
XPG基因第8外显子,c. 706C > G (p. Leu 236Val),phylop”和“phastcons”值分别为“0.122”和“0.058”。该位点序列低度保守,变异为轻度有害突变。
XPG基因第15外显子,c. 346C > G (p. Thr117Met),phylop”和“phastcons”值分别为“0.178”和“0.053”。该位点序列低度保守,变异为轻度有害突变。
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Table 1. Primer sequence of XPA gene amplification
表1. XPA基因扩增的引物序列
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Table 2. Primer sequence of XPB(ERCC3) gene amplification
表2. XPB(ERCC3)基因扩增的引物序列
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Table 3. Primer sequence of XPC gene amplification
表3. XPC基因扩增的引物序列
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Table 4. Primer sequence of XPD(ERCC2) gene amplification
表4. XPD(ERCC2)基因扩增的引物序列
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Table 5. Primer sequence of XPE(DDB1) gene amplification
表5. XPE(DDB1)基因扩增的引物序列
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Table 6. Primer sequence of XPF(ERCC4) gene amplification
表6. XPF(ERCC4)基因扩增的引物序列
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Table 7. Primer sequence of XPG(ERCC5) gene amplification
表7. XPG(ERCC5)基因扩增的引物序列
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Table 8. Primer sequence of XPH(POLH) gene amplification
表8. XPH(POLH)基因扩增的引物序列
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Table 9. Primer sequence of XPI(ERCC1) gene amplification
表9. XPI(ERCC1)基因扩增的引物序列
(A) (B) 面部密集分布的的雀斑样色素沉着点,左眼下眼睑见一肿物;(C) 患者术后面部照片; (D) 患者同时患者慢性睑缘炎、翼状胬肉及白内障。
Figure 1. Photos of the patient’s face, tumor and anterior segment
图1. 患者面部、肿物以及眼前节照片
(A) 手术切除后组织;(B) H-E染色显微镜下观察:肿物表面过度角化肿物与周围界限清楚,周围间质内可见大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及组织细胞浸润(×200倍)。
Figure 2. Tumor tissue and pathological section
图2. 肿物组织及病理切片
第260位碱基出现A > G杂合性改变:c. 260A > G (p.Lys87Arg)。
Figure 3. Sequencing results of exon 14 of XPB gene
图3. XPB基因外显子14测序结果
第312位碱基出现A > G杂合性改变:c. 312A > G (无义突变)。
Figure 4. Sequencing results of exon 14 of XPB gene
图4. XPB基因外显子14测序结果
第39位碱基出现T > C杂合性改变:c. 39T > C (无义突变)。
Figure 5. Sequencing results of exon 8 of XPC gene
图5. XPC基因外显子8测序结果
第506位碱基出现T > C杂合性改变:c. 506T > C (p. Leu169Ser)。
Figure 6. Sequencing results of exon 9 of XPC gene
图6. XPC基因外显子9测序结果
第211位碱基出现A > C杂合性改变:c. 211A > C (p. Ser71Arg)。
Figure 7. Sequencing results of exon 16 of XPC gene
图7. XPC基因外显子16测序结果
第108位碱基出现C > A杂合性改变:c. 108C > A (无义突变)。
Figure 8. Sequencing results of exon 6 of XPD gene
图8. XPD基因外显子6测序结果
第488位碱基出现C > T杂合性改变:c. 488C > T (p. Pro 163Leu)。
Figure 9. Sequencing results of exon 11 of XPF gene
图9. XPF基因外显子11测序结果
第50位碱基出现C > T杂合性改变:c. 50C > T (p. Thr17Met)。
Figure 10. Sequencing results of exon 2 of XPG gene
图10. XPG基因外显子2测序结果
第48位碱基出现A > T杂合性改变:c. 48A > T (无义突变)。
Figure 11. Sequencing results of exon 4 of XPG gene
图11. XPG基因外显子4测序结果
第706位碱基出现C > G杂合性改变:c. 706C > G (p. Leu236Val)。
Figure 12. Sequencing results of exon 8 of XPG gene
图12. XPG基因外显子8测序结果
第346位碱基出现C > G杂合性改变:c. 346C > G (p. Thr117Met)。
Figure 13. Sequencing results of exon 15 of XPG gene
图13. XPG基因外显子15测序结果
第33位碱基出现C > T杂合性改变:c. 33C > T (无义突变)。
Figure 14. Sequencing results of exon 3 of XPI gene
图14. XPI基因外显子3测序结果
4. 讨论
XP系一种罕见的常染色体隐性遗传病,发病率低,XP是因皮肤对紫外线照射引发的DNA脱氧胸腺嘧啶二聚体切除修复缺陷 [1] [2]。该病多于幼年时发病,75%患者发病年龄为生后6个月至3岁,临床表现主要为:发病初期在皮肤暴露部位,如颜面部、口唇部、颈部及小腿等部位出现雀斑和皮肤发干,类似日光性皮炎,继而出现持久性网状毛细血管扩张。且在红斑基础上可出现大小不等的灰色或灰褐色斑片、雀斑样皮损或点状色素脱失斑,有时可见结痂性和大疱性损害 [6] [7]。随着年龄增长,可致眼部损害,如结膜炎、角膜新生血管化、干眼、角膜瘢痕、睑外翻、睑缘炎、结膜黑色素沉着和白内障等,头颈部皮肤多发性肿瘤、内脏肿瘤及神经损害等,并可于3~4年内出现恶性肿瘤 [2] [8]。XP无明显种族差异,近亲结婚为该病的危险因素之一 [9]。XPA,XPE负责识别DNA中的光产物,功能上XPA验证蛋白质是否处于正确位置,然后核酸酶XPG和XPF切割两侧损伤的DNA并用完整的DNA替换。通常情况下核苷酸切除修复包括转录偶联修复以及整组修复。XPC和XPE蛋白只在整组修复中起到作用,其他的XP蛋白在两个修复过程中都有作用。因此XPC、XPE基因缺陷的患者症状相对轻一点,一般不会出现神经异常 [10]。按分型标准 [11],XP分为3型:典型XP、类着色性干皮病型和XP变异型。典型XP的发病早(均在5岁前),皮损遍及全身,DNA修复功能缺陷;XP变异型,患者有典型XP症状,同时伴发育迟缓、智力低下等神经精神症状;类着色性干皮病,虽有典型XP症状,但发病晚,皮损局限于暴露部分,症状较轻。本患者面部密集雀斑,同时伴有慢性睑缘炎、翼状胬肉、白内障等眼部损害,可诊断为XP。但发病年龄较晚,且无明显神经精神症状,属类着色性干皮病型。可能与患者采取了较好的防护措施、以及致病基因突变为XPC未能引起严重蛋白表达改变有关。
角化棘皮瘤是一种生长迅速的皮肤肿瘤 [5],其介于良性与恶性肿瘤之间,亦有学者倾向于其为恶性肿瘤,认为是一种高分化的鳞状细胞癌 [12] [13]。角化棘皮瘤好发于中老年人皮肤暴露在日光照射部位,如面部、头颈部、前臂和手背部等 [5]。角化棘皮瘤的组织病理学特征为表皮凹陷如火山口样,其中充以角栓,底部表皮凸增生呈条索状向真皮内不规则延伸,增生表皮内可见角化珠。火山口周围表皮呈唇样突出,有细胞质嗜酸性淡染的体积大的鳞状细胞伸向真皮,可见核分裂象,真皮内炎性细胞浸润明显。本例患者长于左眼下睑下方近鼻根部,切除肿物送组织病理学检查结果均证实为角化棘皮瘤。XP与角化棘皮瘤的发生均与日光暴晒有关,但XP是否可诱发角化棘皮瘤尚待进一步研究证实。
基金项目
常州市科技项目(CJ20190062)。
NOTES
*通讯作者。